A型流感病毒PB1-F2与宿主MOAP-1蛋白的相互作用

发布时间：2021-06-11 01:17

　　2001年chen等人发现了一种新的A型流感病毒蛋白—PB1-F2,该蛋白被认为是A型流感病毒重要的毒力因子之一。大量的研究显示PB1-F2蛋白在宿主细胞中具有多效性,PB1-F2定位于线粒体上并诱导细胞凋亡;可促进宿主继发性细菌感染;能增强病毒聚合酶的活性。凋亡调节因子1（modulator of apoptosis 1,MOAP-1）在细胞线粒体中可与Bax相互作用,当在哺乳动物细胞中过表达时,能够引发细胞凋亡。目前,关于PB1-F2与宿主蛋白相互作用引发宿主细胞线粒体调亡的分子机制尚不是十分清楚。本研究利用293T细胞提取总RNA并成功扩增了 MOAP-1基因,然后将MOAP-1基因构建到诱饵载体pACT2上。将实验室已有的pGBKT7-PBl-F2和新构建好的pACT2-MOAP-1载体分别转化到酵母细胞中,再将两种酵母菌液16℃条件融合24h左右,融合后利用缺陷性培养基进行单克隆筛选,成功地筛选出了阳性克隆。同时利用酵母双杂交回转实验和半乳糖苷酶活性实验,对阳性克隆做进一步验证。为了进一步确证PB1-F2与MOAP-1存在相互作用,构建了 MOAP-1基因的多种原核和真核表达... 

【文章来源】：吉林农业大学吉林省

【文章页数】：44 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图３．１质粒ｐＧＢＫＴ７－ＰＢ卜Ｆ２的ＰＣＲ及酶切鉴定??Ｆｉｇｕｒｅ３．?１?ＰＣＲ?Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ?ａｎｄ?Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＧＢＫＴ７－ＰＢｌ－Ｆ２??

＋?ＰＡＣＴ２－ＭＯＡＰ－１?（０?的载体组）；３．?ｐＧＢＫＴ７?＋?ｐＡＣＴ２?（空白对照组）；４．?ｐＧＢＫＴ７－Ｐ５３??＋?ｐＡＣＴ２－Ｔ?ａｎｔｉｇｅｎ?（阳性对照组）。四组转化菌涂布在ＳＤ／－Ｔｒｐ／－Ｌｅｕ和??８〇／－丁印／－１＾／－迚３／＾＾固体培养基上，３０°（：培养３？５天，生长情况见图３．３。由图可知，１??组和３组没有阴性克隆生长，这和理论的阴性和空白对照组不能生长的结果一致：２组和４??组有阳性克隆生长且长势相似，这一结果表明ＰＧＢＫＴ７－ＰＢ１－Ｆ２和ｐＡＣＴ２－ＭＯＡＰ－ｌ酵母表??１９??

地验证了二者之间的相互作用。??典??图３．?３酵母回转化实验??Ｆｉｇｕｒｅ?３．３?Ｒｅ－ｔｒａｎｓｆｏｎｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｙｅａｓｔ??３．?１．４?０半乳糖苷酶活性检测??为了进一步验证ｐＧＢＫＴ７＿ＰＢ卜Ｆ２与ｐＡＣＴ２＿Ｍ０ＡＰ－１的相互作用，通过滤纸分析法检??测阳性酵母中Ｐ半乳糖苷酶的活性，同样将试验分成４组：ｌ．ｐＧＢＫＴ７－ＰＢｌ－Ｆ２?＋??ＰＡＣＴ２－Ｍ０ＡＰ－１?（目的载体组＞?；２．ｐＧＢＫＴ７－Ｐ５３?＋?ｐＡＣＴ２－Ｔ?ａｎｔｉｇｅｎ?（阳性对照组）；３．??ｐＧＢＫＴ７?＋?ｐＡＣＴ２?（空白对照组）；４．?ｐＡＣＴ２－Ｔ?＋?ｐＧＢＫＴ７＿ＬａｍｉｎＣ?（阴性对照组）。结果??见图３．４，由图可知１号的ｐＧＢＫＴ７－ＰＢ１－Ｆ２与ｐＡＣＴ２－Ｍ０ＡＰ－ｌ共转的酵母菌裂解液和２??号阳性对照组的酵母菌裂解液能在Ｚ－Ｂｕｆｆｅｒ／Ｘ－ｇａｌ的滤纸片上变蓝，而３号空白对照组和４??号阴性对照组不变蓝。对比１号和２号发现，滤纸片上的变蓝程度相差不大，说明??ＰＧＢＫＴ７－ＰＢ卜Ｆ２与ｐＡＣＴ２＿Ｍ０ＡＰ－１的相互作用和阳性对照组的相互作用的强度相当


本文编号：3223503