MicroRNA-7-5p调控热处理促进胰岛素刺激的仔猪睾丸支持细胞乳酸分泌的分子机制
发布时间：2021-06-12 00:03
miRNA（MicroRNA）是一类内源性短链非编码小RNA,通过翻译抑制或m RNA降解在转录后控制基因表达,参与细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生等过程,在生物体内的调控机制中发挥着重要的作用。睾丸支持细胞（Sertoli cells,SCs）除了为生精细胞提供结构支持,还能够合成并分泌乳酸,为发育中的生精细胞提供营养底物,其乳酸合成过程常常受到胰岛素等激素调控。前期研究发现温和热处理（以下简称热处理）能够提高胰岛素受体底物2（IRS2）的表达,促进PI3K/Akt信号通路活化,以提高胰岛素敏感性,但热处理促进IRS2表达的分子机制尚未明确,miRNA是否介导热处理后胰岛素刺激的支持细胞乳酸生成还有待研究。本实验首先通过TargetScan、miRWalk和MiRBase等软件及数据库预测与IRS2表达相关的miRNA,然后使用21日龄的仔猪睾丸支持细胞作为实验材料,以43°C,30min对细胞进行热处理,提取细胞总RNA,利用定量PCR技术筛选热处理后表达发生变化的miRNA。根据筛选结果,人工合成miRNA mimic与miRNA inhibitor,并在Lipofectamine...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
体外分离培养的支持细胞与其纯度鉴定A.体外培养的支持细胞（100×）
西南大学硕士学位论文34MarkerControlHeattreat28s18s1.8~2.0之间，表明提取的RNA纯度达到实验的基本需求。浓度检测显示，对照组及热处理组的RNA浓度均在300ng/μl~400ng/μl之间，满足下一步实验的需求。综合说明提取的RNA样品纯度好、质量高，可直接用后续实验。图4-2RNA完整性检测Figure.4-2TheintegritydetectionoftotalRNA4.3热处理对IRS2相关miRNA的影响通过TargetScan、miRWalk和MiRBase等软件及数据库预测靶向调控IRS2的miRNA，在此过程中发现在猪这个物种中靶向调控IRS2的miRNA数量非常少，最终筛选出7个可能的miRNAs，包括ssc-miR-96-5p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-7-5p、ssc-miR-142-5p、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-150和ssc-miR-155-5p。利用定量PCR检测热处理对上述7个miRNA表达的影响。图4-3A展示了miRNAs和U6的扩增过程，扩增基线平滑，曲线呈标准的“S”型，表明扩增过程中几乎没有受到外界的干扰。同时各溶解曲线呈现平稳的单峰，说明扩增引物特异性较好，扩增结果具有可信度（图4-3B）。U6从10~20个循环开始起峰，达到作为内参的基本要求。从图4-3C可以看出，热处理后仅ssc-miR-7-5p表达水平显著下调，其余miRNA的表达水平均无明显变化。与对照组相比，热处理使细胞中ssc-miR-7-5p的水平降低了41.2%（P<0.01），表明ssc-miR-7-5p对热处理的刺激非常敏感，接下来选定ssc-miR-7-5p作为后续研究对象。
第4章实验结果37过质量检测的DNA为模板进行高保真PCR扩增，通过条带数量和对应的片段大小判断引物特异性。从4-4-1D可以发现，扩增产物为单一明亮的条带，位置靠近200bp，预期目的片段位置一到处，说明设计的上下游引物特异性较好。图4-4-1miRNA靶位点预测及DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定A.miR7-5p与IRS2靶位点预测B.种子序列在不同物种中的保守性C.DNA完整性鉴定D.IRS23’UTR片段扩增产物Fig4-4-1PredictionofmiRNAtargetsiteandidentificationofDNAagarosegelelectrophoresisA.PredictionforTargetSitesofmiR7-5pinIRS23’UTRB.ConservationofseedsequencesindifferentspeciesC.DNAintegrityidentificationD.AmplificationproductsofIRS23"UTRfragment4.4.2构建重组质粒实验中构建重组质粒采用的载体为psiCHECK-2，包含有后续双荧光素酶报告基因检测实验所需的基因结合位点：NotⅠ与XhoⅠ（4-4-2A）。将上一步高保真扩增后的DNA产物送样检测，合格后与psiCHECK-2载体按分子克隆方法进行酶
本文编号：3225531
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
体外分离培养的支持细胞与其纯度鉴定A.体外培养的支持细胞（100×）
西南大学硕士学位论文34MarkerControlHeattreat28s18s1.8~2.0之间，表明提取的RNA纯度达到实验的基本需求。浓度检测显示，对照组及热处理组的RNA浓度均在300ng/μl~400ng/μl之间，满足下一步实验的需求。综合说明提取的RNA样品纯度好、质量高，可直接用后续实验。图4-2RNA完整性检测Figure.4-2TheintegritydetectionoftotalRNA4.3热处理对IRS2相关miRNA的影响通过TargetScan、miRWalk和MiRBase等软件及数据库预测靶向调控IRS2的miRNA，在此过程中发现在猪这个物种中靶向调控IRS2的miRNA数量非常少，最终筛选出7个可能的miRNAs，包括ssc-miR-96-5p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-7-5p、ssc-miR-142-5p、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-150和ssc-miR-155-5p。利用定量PCR检测热处理对上述7个miRNA表达的影响。图4-3A展示了miRNAs和U6的扩增过程，扩增基线平滑，曲线呈标准的“S”型，表明扩增过程中几乎没有受到外界的干扰。同时各溶解曲线呈现平稳的单峰，说明扩增引物特异性较好，扩增结果具有可信度（图4-3B）。U6从10~20个循环开始起峰，达到作为内参的基本要求。从图4-3C可以看出，热处理后仅ssc-miR-7-5p表达水平显著下调，其余miRNA的表达水平均无明显变化。与对照组相比，热处理使细胞中ssc-miR-7-5p的水平降低了41.2%（P<0.01），表明ssc-miR-7-5p对热处理的刺激非常敏感，接下来选定ssc-miR-7-5p作为后续研究对象。
第4章实验结果37过质量检测的DNA为模板进行高保真PCR扩增，通过条带数量和对应的片段大小判断引物特异性。从4-4-1D可以发现，扩增产物为单一明亮的条带，位置靠近200bp，预期目的片段位置一到处，说明设计的上下游引物特异性较好。图4-4-1miRNA靶位点预测及DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定A.miR7-5p与IRS2靶位点预测B.种子序列在不同物种中的保守性C.DNA完整性鉴定D.IRS23’UTR片段扩增产物Fig4-4-1PredictionofmiRNAtargetsiteandidentificationofDNAagarosegelelectrophoresisA.PredictionforTargetSitesofmiR7-5pinIRS23’UTRB.ConservationofseedsequencesindifferentspeciesC.DNAintegrityidentificationD.AmplificationproductsofIRS23"UTRfragment4.4.2构建重组质粒实验中构建重组质粒采用的载体为psiCHECK-2，包含有后续双荧光素酶报告基因检测实验所需的基因结合位点：NotⅠ与XhoⅠ（4-4-2A）。将上一步高保真扩增后的DNA产物送样检测，合格后与psiCHECK-2载体按分子克隆方法进行酶
本文编号：3225531
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