颗粒细胞过表达FSHR对猪卵母细胞体外成熟的影响研究

发布时间：2021-06-15 11:29

　　自Mattioli等于1988年首次对猪卵母细胞体外成熟（IVM）研究以来,在许多研究人员的努力下,虽然猪卵母细胞IVM体系得到了较大的改进和优化,但是IVM效果依然较差。影响卵母细胞IVM效果的因素有许多,如：IVM基础培养液的成分；IVM培养液中的添加成分：激素及其浓度、细胞因子、卵泡液、抗氧化物质及维生素等；采取卵子的卵泡直径大小；卵母细胞周围包裹卵丘细胞的有无及数量多少；成熟培养时的温度、气相条件以及成熟培养时间等等。IVM过程中卵母细胞的核质成熟往往不同步,这也是导致IVM效果较差的关键因素之一。为了有效推动猪卵母细胞核质同步成熟,提高猪卵母细胞IVM效率,本研究在IVM中首次对颗粒细胞（GCs） FSH受体的过表达展开设计,采用带有新型荧光蛋白基因的慢病毒载体介导FSH受体基因转染GCs,实现FSH受体在GCs膜上长期、稳定的过表达。将卵母细胞与转染后的GCs共培养进行IVM,通过分析核质成熟的进程,阐明GCs膜上FSH受体过表达对猪卵母细胞核质成熟的调节机制,并以此来提高猪卵母细胞体外培养的成熟率。本试验具体从以下几个方面进行了研究：1.猪FSHR基因的克隆及慢病毒表达载... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
目录
摘要
ABSTRACT
英文缩写说明
第一章 猪卵母细胞IVM及FSHR的研究进展
    1. 卵母细胞在体内发生、发育简介
        1.1 卵泡的发育和成熟
        1.2 卵子在体内的发生和形态结构
    2. 卵母细胞体外成熟(IVM)介绍
        2.1 卵母细胞体外成熟培养基础培养液
        2.2 基础培养液中添加成分
        2.3 卵巢供体的动物种类年龄、所采集的卵泡大小及采集方式和采集的卵子质量
        2.4 卵母细胞体外成熟培养的条件
    3. 促卵泡素(FSH)和促黄体生成素(LH)对卵母细胞体外成熟发育的影响
    4. 促卵泡素受体(FSHR)基因及其蛋白质结构简介
    5. 慢病毒载体
第二章 猪FSHR克隆及慢病毒载体构建
    1. 实验材料
        1.1 卵巢总RNA提取组织
        1.2 菌株和质粒
        1.3 试验试剂及仪器
    2. 实验方法
        2.1 卵巢组织总RNA的提取、反转录及FSHR基因的扩增
        2.2 pMD19-T-FSHR载体的构建、转化、克隆与鉴定
        2.3 将FSHR基因从pMD19-T-FSHR重组载体质粒上酶切下来
        2.4 慢病毒重组载体CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus的构建
    3. 实验结果及分析
    4. 讨论
第三章 猪卵泡颗粒细胞的培养
    1. 实验材料
        1.1 卵巢组织
        1.2 主要试剂及配制
        1.3 主要试验仪器
    2. 实验方法
        2.1 猪原代卵泡颗粒细胞的培养
        2.2 猪原代卵泡颗粒细胞传代扩大培养
        2.3 猪卵泡颗粒细胞的冻存
        2.4 猪卵泡颗粒细胞的解冻
    3. 实验结果及分析
    4. 讨论
        4.1 卵巢表面的消毒处理
        4.2 消化酶的选择
        4.3 卵泡液内红细胞与淋巴细胞的处理
        4.4 颗粒细胞的快速大量培养
第四章 慢病毒的包装与感染力测定
    1. 实验材料
        1.1 质粒
        1.2 主要试剂及配制
        1.3 主要试验仪器
    2. 实验方法
        2.1 三质粒用无内毒素大提试剂盒大量提取
        2.2 293T细胞的解冻与培养
        2.3 293T细胞的准备、病毒的包装与感染力观察
    3. 结果及分析
    4. 讨论
第五章 重组载体CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus电击法转染颗粒细胞并与卵母细胞共IVM
    1. 实验材料
        1.1 猪卵巢组织
        1.2 主要试剂及配制
        1.3 主要试验仪器
    2. 试验方法
        2.1 用Lipofectamine~(TM)2000分别转染293T细胞和猪卵泡颗粒细胞
        2.2 电击法将CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus转染猪原代卵泡颗粒细胞
        2.3 CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus转染的颗粒细胞与卵子共IVM
    3. 结果及分析
    4. 讨论
        4.1 重构慢病毒载体质粒CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus转染猪卵泡颗粒细胞
        4.2 猪卵母细胞IVM
        4.3 转染CSⅡ-EF-FSHR-IRES2-Venus质粒的颗粒细胞与卵母细胞共培养
        4.4 颗粒细胞过表达FSHR对卵母细胞体外成熟影响的分析
全文总结
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]FSH+LH添加方式、半胱氨酸、EGF对猪IVM卵母细胞早期孤雌发育的影响[J]. 许惠艳,苏克同,何若钢,梁世忠,卢晟盛,卢克焕.  西南农业学报. 2010(03)
[2]卵泡FSH受体mRNA的表达及其对卵母细胞体外培养成熟率的影响[J]. 范叶,袁安文,薛立群,许道军.  中国畜牧兽医. 2006(02)
[3]猪卵母细胞在不同条件下的体外成熟培养[J]. 胡军和,杨春荣,窦忠英.  农业生物技术学报. 2005(05)
[4]卵泡液和胚胎培养液中氧化损伤的研究现状[J]. 宋亚丽,邢福祺.  广东医学. 2005(10)
[5]促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 卢晟盛,卢克焕.  西南农业大学学报(自然科学版). 2004(06)
[6]颗粒细胞上促卵泡素受体与体外受精-胚胎移植的相关研究[J]. 徐素欣,赵志明,沈鸿敏,左一鹏,宋时莉.  中国优生与遗传杂志. 2004(01)
[7]猪卵巢卵母细胞的收集和体外成熟培养[J]. 陈晓宇,刘东,李青旺,张德福,李震,于瑞嵩,刘惠莉,周宗清.  上海农业学报. 2003(02)
[8]PMSG和hCG对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 蔡令波,王锋,顾熟琴,杭苏琴,牛树理.  畜牧与兽医. 2002(12)
[9]超排卵时卵巢对促性腺激素的反应与颗粒细胞促卵泡激素受体的表达[J]. 楼航英,黄荷凤,金帆.  浙江大学学报(医学版). 2002(03)
[10]猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟研究[J]. 孟庆刚,张成林,张永忠,李光鹏,谭景和.  畜牧兽医学报. 2001(03)



本文编号：3230973