沉默TLR2和TLR9基因对BHV-1感染EBTr细胞的影响
发布时间：2021-06-18 07:53
为研究牛胚胎气管细胞的TOLL样受体2（TLR2）和TOLL样受体9（TLR9）在牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-1）感染的天然免疫反应中的作用,本研究利用小分子干扰RNA（siRNA）技术,以TLR2和TLR9为靶向分别设计并合成3条siRNA干扰序列,用SYBR Green Ⅰ定量PCR技术筛选出最佳的siRNA-TLR2和siRNA-TLR9干扰序列,继而转染EBTr细胞使其沉默TLR2和TLR9后感染BHV-1,分析对BHV-1增殖规律及细胞因子IL-6、TNF-α和IFN-β表达的影响。结果显示,在 EBTr 细胞中转染 siRNA-TLR2A、siRNA-2B 和 siRNA-TLR2C 48h后对TLR2 mRNA表达量下调了 35.05%、69.20%和84.85%,筛选出的siTLR2C片段在1272 h可以显著抑制TLR2 mRNA表达（p<0.05）,用该片段转染EBTr细胞再感染BHV-1后672 h,siRNA-TLR2组BHV-1 DNA拷贝数显著低于对照组（p<0.05）,在EBTr细胞中转染siRNA-TL...
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＲＮＡｉ的作用机制［６８］??Ｆｉｇ．?１?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＲＮＡｉ?ａｃｔｉｏｎ??
１５??对一个视野中所有细胞贴壁细胞进行计数，然后在同一视野中转换至激发??波长为５６５?ｎｍ的荧光滤镜下对发红色荧光的细胞进行计数（图３）。当转??染试剂的体积为７．５?ＭＬ／孔，干扰片段的量为２５?ｐｍｏｌ／孔时转染效率就达到??了较好的转染效果。??ａ?－??＿??■??图３?脂质体转染阳性样品后的ＥＢＴｒ细胞（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．３?Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＥＢＴｒ?ｃｃｌｊｓ?（?＞?２００?）??注：Ａ．脂质体转染阳性样品至ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ后的〇光显微镜照片；Ｂ．脂质体转染阳性样??品至ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ后的荧光显微镋照片；Ｃ．对照组转染ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ的白光显微镜照片；??Ｄ．对照组转染ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ的荧光显微镜照片。??Ａ．?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｗｈｉｔｅ?ｌｉｇｈｔ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｔｈｅ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?２４?ｈ?ｂｙ??ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ?：?Ｂ．?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｔｈｅ??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?２４?ｈ?ｂｙ?ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ；Ｃ．?Ｔｈｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ
用标准品分别绘制各自的扩增曲线图、标准曲线图和溶解曲线图，各??稀释梯度的标准品生成的扩増曲线的Ｃｔ值都接近等差出现于基准线上，表??示出了良好的线性关系（图４、图７、图１０），ＴＬＲ２、（３－ａｃｔｉｎ和ＴＬＲ９的标??准曲线斜率分别为－３．４６５、－３．５６０和－３．３９０，扩增效率分别为９４．３４２％、??９０．９４１?％和９７．２２０％?，相关系数都是Ｒ２＝?０．９９９?（图５、图８、图１１），溶??解曲线均出现单一峰，表明引物具有很好的特异性，（图６、图９、图１２）。??４．２５０．０Ｃ３?：??－？，０００．０００?ｉ??３．７５ａ？〇ｊ??３．５３ａ．〇ｃ〇ｉ?ｚ．’’?，，??３＾０．〇０〇ｉ??．?丨?？?／?—么???３．０９０．０００＾?／：一－一一；，??２，７５０．０００－｝?／?／??ｃ?２．５００．Ｋ３０）?．’?／?／?／??＜?２＾５０．００５１?／?／?／?／??２＾ｏｍ＼?Ｉ?／?／?／??ｊ?／?／?／??？Ｓ？?．?．．?．?１?．?／?！?ｔ?；??？?？一－?—?－?■?￣?７?；?■?ｊ?ｊ?ｆ??／?／?／?／??１．ＣＯＣ．ＯＳＯ?ｊ?／?／?／?／??７５０
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛传染性鼻气管炎疫苗研究进展[J]. 刘瑞宁,邓明亮,刘玉辉,陈颖钰,郭爱珍. 动物医学进展. 2016(02)
[2]牛传染性鼻气管炎的流行与防控进展[J]. 李程,陈颖钰,索朗斯珠,郭爱珍. 中国奶牛. 2015(17)
[3]国内外奶牛主要病毒病的流行现状及防控技术研究进展[J]. 王洪梅,侯佩莉,宋玲玲,赵贵民,何洪彬. 中国畜牧杂志. 2014(10)
[4]主动靶向脂质体研究进展[J]. 左勇亮,肖人钟,王蓉蓉. 中国现代应用药学. 2013(10)
[5]靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定[J]. 张宇飞,刘月,张亚坤,刘淑英. 中国兽医科学. 2013(01)
[6]大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定[J]. 张赟,龚敏,毕杨,江伟,喻琴,李廷玉,陈洁. 细胞与分子免疫学杂志. 2012(02)
[7]不同转染方法转染牛体细胞效率的比较[J]. 李松,丁方荣,戴蕴平,朱士恩. 农业生物技术学报. 2011(06)
[8]正痘病毒干扰宿主免疫应答的分子及其作用途径[J]. 景志忠,贾怀杰,周涛,何小兵. 畜牧兽医学报. 2011(11)
[9]机体识别病毒核酸的几种分子模式及途径[J]. 景志忠,何小兵,房永祥,陈国华,曾爽,贾怀杰. 畜牧兽医学报. 2011(03)
[10]Toll样受体的信号转导及抗感染免疫研究进展[J]. 罗兵,李涛,徐元宏. 免疫学杂志. 2011(02)
硕士论文
[1]BHV-1感染对牛胚气管细胞TLR2和TLR9表达的影响[D]. 徐丽媛.内蒙古农业大学 2016
[2]IBRV对牛单核巨噬细胞表达细胞因子的影响[D]. 陈玉惠.内蒙古农业大学 2013
[3]辽宁省牛、羊BVDV、IBRV血清流行病学调查与IBRV病毒分离鉴定[D]. 李树博.中国农业科学院 2012
本文编号：3236279
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＲＮＡｉ的作用机制［６８］??Ｆｉｇ．?１?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ＲＮＡｉ?ａｃｔｉｏｎ??
１５??对一个视野中所有细胞贴壁细胞进行计数，然后在同一视野中转换至激发??波长为５６５?ｎｍ的荧光滤镜下对发红色荧光的细胞进行计数（图３）。当转??染试剂的体积为７．５?ＭＬ／孔，干扰片段的量为２５?ｐｍｏｌ／孔时转染效率就达到??了较好的转染效果。??ａ?－??＿??■??图３?脂质体转染阳性样品后的ＥＢＴｒ细胞（Ｘ?２００）??Ｆｉｇ．３?Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ?ｏｆ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ＥＢＴｒ?ｃｃｌｊｓ?（?＞?２００?）??注：Ａ．脂质体转染阳性样品至ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ后的〇光显微镜照片；Ｂ．脂质体转染阳性样??品至ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ后的荧光显微镋照片；Ｃ．对照组转染ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ的白光显微镜照片；??Ｄ．对照组转染ＥＢＴｒ细胞２４?ｈ的荧光显微镜照片。??Ａ．?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｗｈｉｔｅ?ｌｉｇｈｔ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｔｈｅ?Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?２４?ｈ?ｂｙ??ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ?：?Ｂ．?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?ａｆｔｅｒ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｔｈｅ??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓａｍｐｌｅｓ?２４?ｈ?ｂｙ?ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ；Ｃ．?Ｔｈｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ＥＢＴｒ?ｃｅｌｌｓ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ
用标准品分别绘制各自的扩增曲线图、标准曲线图和溶解曲线图，各??稀释梯度的标准品生成的扩増曲线的Ｃｔ值都接近等差出现于基准线上，表??示出了良好的线性关系（图４、图７、图１０），ＴＬＲ２、（３－ａｃｔｉｎ和ＴＬＲ９的标??准曲线斜率分别为－３．４６５、－３．５６０和－３．３９０，扩增效率分别为９４．３４２％、??９０．９４１?％和９７．２２０％?，相关系数都是Ｒ２＝?０．９９９?（图５、图８、图１１），溶??解曲线均出现单一峰，表明引物具有很好的特异性，（图６、图９、图１２）。??４．２５０．０Ｃ３?：??－？，０００．０００?ｉ??３．７５ａ？〇ｊ??３．５３ａ．〇ｃ〇ｉ?ｚ．’’?，，??３＾０．〇０〇ｉ??．?丨?？?／?—么???３．０９０．０００＾?／：一－一一；，??２，７５０．０００－｝?／?／??ｃ?２．５００．Ｋ３０）?．’?／?／?／??＜?２＾５０．００５１?／?／?／?／??２＾ｏｍ＼?Ｉ?／?／?／??ｊ?／?／?／??？Ｓ？?．?．．?．?１?．?／?！?ｔ?；??？?？一－?—?－?■?￣?７?；?■?ｊ?ｊ?ｆ??／?／?／?／??１．ＣＯＣ．ＯＳＯ?ｊ?／?／?／?／??７５０
【参考文献】：
期刊论文
[1]牛传染性鼻气管炎疫苗研究进展[J]. 刘瑞宁,邓明亮,刘玉辉,陈颖钰,郭爱珍. 动物医学进展. 2016(02)
[2]牛传染性鼻气管炎的流行与防控进展[J]. 李程,陈颖钰,索朗斯珠,郭爱珍. 中国奶牛. 2015(17)
[3]国内外奶牛主要病毒病的流行现状及防控技术研究进展[J]. 王洪梅,侯佩莉,宋玲玲,赵贵民,何洪彬. 中国畜牧杂志. 2014(10)
[4]主动靶向脂质体研究进展[J]. 左勇亮,肖人钟,王蓉蓉. 中国现代应用药学. 2013(10)
[5]靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定[J]. 张宇飞,刘月,张亚坤,刘淑英. 中国兽医科学. 2013(01)
[6]大鼠Toll样受体2基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定[J]. 张赟,龚敏,毕杨,江伟,喻琴,李廷玉,陈洁. 细胞与分子免疫学杂志. 2012(02)
[7]不同转染方法转染牛体细胞效率的比较[J]. 李松,丁方荣,戴蕴平,朱士恩. 农业生物技术学报. 2011(06)
[8]正痘病毒干扰宿主免疫应答的分子及其作用途径[J]. 景志忠,贾怀杰,周涛,何小兵. 畜牧兽医学报. 2011(11)
[9]机体识别病毒核酸的几种分子模式及途径[J]. 景志忠,何小兵,房永祥,陈国华,曾爽,贾怀杰. 畜牧兽医学报. 2011(03)
[10]Toll样受体的信号转导及抗感染免疫研究进展[J]. 罗兵,李涛,徐元宏. 免疫学杂志. 2011(02)
硕士论文
[1]BHV-1感染对牛胚气管细胞TLR2和TLR9表达的影响[D]. 徐丽媛.内蒙古农业大学 2016
[2]IBRV对牛单核巨噬细胞表达细胞因子的影响[D]. 陈玉惠.内蒙古农业大学 2013
[3]辽宁省牛、羊BVDV、IBRV血清流行病学调查与IBRV病毒分离鉴定[D]. 李树博.中国农业科学院 2012
本文编号：3236279
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