毛皮动物肺炎克雷伯氏菌分离菌株的系统发育分析及其微胶囊疫苗的研制
发布时间：2021-06-26 03:27
肺炎克雷伯氏菌是一种条件致病菌，过去人们认为对畜禽危害不大，一直未引起重视。但是近年来关于肺炎克雷伯氏菌引起毛皮动物疾病的报道却在迅速增加，加之各种抗菌药物的广泛使用，导致该菌的耐药性增强，多重耐药菌株的出现，肺炎克雷伯氏菌病在毛皮动物养殖业中危害越来越严重，因此随着环境的改变，肺炎克雷伯氏菌作为人畜共患传染病的病原，应引起广泛的重视。本研究对肺炎克雷伯氏菌在传统的理化特性鉴定基础上，又对12株不同动物来源的代表性菌株进行了23S rRNA基因序列的分析、构建了系统发育树，比较各菌种属间的差异，为肺炎克雷伯氏菌在分子水平的系统学研究和遗传多样性研究奠定基础，建立了一种快速、简便的肺炎克雷伯氏菌的鉴定方法和23S rRNA基因序列分析方法。由于目前市场上尚没有有效的肺炎克雷伯氏菌疫苗用于该病的防治，致使该病得不到合理有效的防治，严重制约着毛皮动物养殖业发展。因此本研究分别以泰山松花粉多糖、蜂胶等为佐剂，利用微胶囊技术制备了肺炎克雷伯氏菌微胶囊疫苗，并口服免疫小白鼠，检测免疫指标，对于肺炎克雷伯氏菌的防治具有重要意义，同时为新型口服疫苗和控释制剂的开发奠定了基础。1.山东部分地区毛皮动物肺...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SrRNA可变区位点结构
该分离菌在血液平板上均呈圆形、隆起、湿润、闪光、边缘整齐、灰白色、不透明、易融合、黏稠、接种环挑起易拉成长丝、生长丰盛的奶油状菌落，其在血液平板上有β型溶血晕。8株分离菌革兰氏染色为阴性，粗短杆菌（图2），单个、成对或个别短链状排列，无鞭毛、有荚膜，菌体大小约为0.3-1.5 μm×0.6-6.0 μm。图2 分离菌株菌落形态及镜检结果Fig.2 Colony characteristics and morphology after Gram stainingA：分离菌株菌落形态；B：分离菌株镜检结果A: Colony characteristics of the bacteria isolates; B: morphology after Gram staining the bacteria isolates3.1.3 生化鉴定结果将不同地区分离率最高的8株有代表性的疑似肺炎克雷伯氏菌分别通过细菌生化试验（微量发酵管）和ATB Expression半自动细菌鉴定仪进行鉴定，8株分离菌的生化特性一致，生化试验结果见表3。表3 分离菌株的生化鉴定结果Table3 Physiological and biochemical characteristics of the bacteria isolates生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result山梨糖 + 肌醇 + 密二糖 + 枸橼酸盐 + 葡萄糖 +棉子糖 + 山梨醇 + 丙二酸盐 + 硫化氢 - 血清菊糖 -蔗糖 + 侧金盏花醇 + 赖氨酸 + 尿素 + 鼠李糖 +麦芽糖 + 甘露醇 + 纤维二糖 + 七叶苷 + 阿拉伯糖 +木糖 + 卫矛醇 - 硝酸盐还原 + 0/F 发酵 + MR -乳糖 + 氰化钾 + β-半乳糖 + ONPG + VP +注:“+”为阳性反应,“-”为阴性反应Note: “+”stands for positive; “-”stands for negative
33图3 小鼠剖检病变结果Fig.3 Necropsy lesions of mouseA：肝脏出血点；B：肝脏坏死A: Haemorrhage nod of liver; B: Necrosis of liver3.1.6 16S rRNA 基因序列与系统发育分析提取以上8株分离菌的基因组，对其16S rRNA扩增,在423 bp处有目的片段，与预期扩增结果一致（图4）。将8株分离菌株所测序列与GenBank收录的肺炎克雷伯氏菌菌株通过DNAStar进行同源性分析，并绘制成系统进化树（图5）。8株分离菌株核苷酸序列之间同源性为99.1%-99.8%，与AY9963633株肺炎克雷伯氏菌（中国河北）核苷酸序列同源性为99.3%-100%，与AB675600株肺炎克雷伯氏菌（日本）核苷酸序列同源性为98.6%-99.1%（图6），结果显示本研究分离的8株分离菌与国内菌株同源性更近。图4 8株分离菌16S rRNA目的基因的PCR结果Fig
【参考文献】：
期刊论文
[1]284株肺炎克雷伯菌的临床分布与耐药性分析[J]. 何宇佳,蔡敏琪,易富. 西南国防医药. 2013(03)
[2]肺炎克雷伯菌的耐药性分析[J]. 张俊平. 河北医药. 2013(04)
[3]4个动物园灵长类动物肠道克雷伯氏菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 赵波,李波,王强,余建秋,杨光友,陈红卫. 中国畜牧兽医. 2013(02)
[4]1株耐亚胺培南肺炎克雷伯菌分型、耐药机制及毒力研究[J]. 徐祥,欧琴,李蓓. 临床检验杂志. 2013(02)
[5]水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J]. 杨艳玲,陈峙峰,王成福,温永俊. 特产研究. 2012(04)
[6]芦丁铋二元配合物微囊制备工艺优选及其质量评价[J]. 张辉,喻莉萍,彭国茳,马红玉,李明,王彬,李强国. 中国实验方剂学杂志. 2012(13)
[7]肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性分析[J]. 蔡萼. 公共卫生与预防医学. 2012(01)
[8]肺炎克雷伯菌330株耐药性分析[J]. 张志云,梁冰. 中国误诊学杂志. 2012(06)
[9]兔肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定[J]. 王孝友,杨睿,沈克飞,杨金龙,张素辉,付利芝,黄伟,王永康,徐刚. 中国兽医杂志. 2012(02)
[10]405株肺炎克雷伯菌感染临床分布与耐药研究[J]. 寿叶女,陈建江,单平囡,甄国东,娄晓寅,鲁玲燕. 中华医院感染学杂志. 2012(03)
博士论文
[1]猪源肺炎克雷伯菌菌毛致病的分子基础及其免疫相关抗原表位的筛选[D]. 贾艳.吉林大学 2007
本文编号：3250537
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
SrRNA可变区位点结构
该分离菌在血液平板上均呈圆形、隆起、湿润、闪光、边缘整齐、灰白色、不透明、易融合、黏稠、接种环挑起易拉成长丝、生长丰盛的奶油状菌落，其在血液平板上有β型溶血晕。8株分离菌革兰氏染色为阴性，粗短杆菌（图2），单个、成对或个别短链状排列，无鞭毛、有荚膜，菌体大小约为0.3-1.5 μm×0.6-6.0 μm。图2 分离菌株菌落形态及镜检结果Fig.2 Colony characteristics and morphology after Gram stainingA：分离菌株菌落形态；B：分离菌株镜检结果A: Colony characteristics of the bacteria isolates; B: morphology after Gram staining the bacteria isolates3.1.3 生化鉴定结果将不同地区分离率最高的8株有代表性的疑似肺炎克雷伯氏菌分别通过细菌生化试验（微量发酵管）和ATB Expression半自动细菌鉴定仪进行鉴定，8株分离菌的生化特性一致，生化试验结果见表3。表3 分离菌株的生化鉴定结果Table3 Physiological and biochemical characteristics of the bacteria isolates生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result生化项目Detection结果Result山梨糖 + 肌醇 + 密二糖 + 枸橼酸盐 + 葡萄糖 +棉子糖 + 山梨醇 + 丙二酸盐 + 硫化氢 - 血清菊糖 -蔗糖 + 侧金盏花醇 + 赖氨酸 + 尿素 + 鼠李糖 +麦芽糖 + 甘露醇 + 纤维二糖 + 七叶苷 + 阿拉伯糖 +木糖 + 卫矛醇 - 硝酸盐还原 + 0/F 发酵 + MR -乳糖 + 氰化钾 + β-半乳糖 + ONPG + VP +注:“+”为阳性反应,“-”为阴性反应Note: “+”stands for positive; “-”stands for negative
33图3 小鼠剖检病变结果Fig.3 Necropsy lesions of mouseA：肝脏出血点；B：肝脏坏死A: Haemorrhage nod of liver; B: Necrosis of liver3.1.6 16S rRNA 基因序列与系统发育分析提取以上8株分离菌的基因组，对其16S rRNA扩增,在423 bp处有目的片段，与预期扩增结果一致（图4）。将8株分离菌株所测序列与GenBank收录的肺炎克雷伯氏菌菌株通过DNAStar进行同源性分析，并绘制成系统进化树（图5）。8株分离菌株核苷酸序列之间同源性为99.1%-99.8%，与AY9963633株肺炎克雷伯氏菌（中国河北）核苷酸序列同源性为99.3%-100%，与AB675600株肺炎克雷伯氏菌（日本）核苷酸序列同源性为98.6%-99.1%（图6），结果显示本研究分离的8株分离菌与国内菌株同源性更近。图4 8株分离菌16S rRNA目的基因的PCR结果Fig
【参考文献】：
期刊论文
[1]284株肺炎克雷伯菌的临床分布与耐药性分析[J]. 何宇佳,蔡敏琪,易富. 西南国防医药. 2013(03)
[2]肺炎克雷伯菌的耐药性分析[J]. 张俊平. 河北医药. 2013(04)
[3]4个动物园灵长类动物肠道克雷伯氏菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 赵波,李波,王强,余建秋,杨光友,陈红卫. 中国畜牧兽医. 2013(02)
[4]1株耐亚胺培南肺炎克雷伯菌分型、耐药机制及毒力研究[J]. 徐祥,欧琴,李蓓. 临床检验杂志. 2013(02)
[5]水貂肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J]. 杨艳玲,陈峙峰,王成福,温永俊. 特产研究. 2012(04)
[6]芦丁铋二元配合物微囊制备工艺优选及其质量评价[J]. 张辉,喻莉萍,彭国茳,马红玉,李明,王彬,李强国. 中国实验方剂学杂志. 2012(13)
[7]肺炎克雷伯菌的临床分布及耐药性分析[J]. 蔡萼. 公共卫生与预防医学. 2012(01)
[8]肺炎克雷伯菌330株耐药性分析[J]. 张志云,梁冰. 中国误诊学杂志. 2012(06)
[9]兔肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定[J]. 王孝友,杨睿,沈克飞,杨金龙,张素辉,付利芝,黄伟,王永康,徐刚. 中国兽医杂志. 2012(02)
[10]405株肺炎克雷伯菌感染临床分布与耐药研究[J]. 寿叶女,陈建江,单平囡,甄国东,娄晓寅,鲁玲燕. 中华医院感染学杂志. 2012(03)
博士论文
[1]猪源肺炎克雷伯菌菌毛致病的分子基础及其免疫相关抗原表位的筛选[D]. 贾艳.吉林大学 2007
本文编号：3250537
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