金龟子绿僵菌合成苦马豆素SwnR基因功能研究

发布时间：2021-06-30 11:02

　　目前研究表明,疯草类有毒植物的毒性成分-苦马豆素（Swainsonine）主要由三类真菌产生,即豆类丝核菌（Rhizocronia leguminicola）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）和棘豆蠕孢菌（Alternaria oxytropis）,而有关苦马豆素生物合成通路及催化酶基因尚不清楚。鉴于此,本试验以金龟子绿僵菌为研究对象,通过PEG介导的方法对金龟子绿僵菌合成苦马豆素疑似催化酶基因SwnR进行敲除并验证其功能,旨在探讨SwnR基因在金龟子绿僵菌苦马豆素生物合成通路中的作用,为深入研究苦马豆素生物合成通路及相关催化酶基因奠定理论基础。试验结果如下:1.根据GeneBank上的标准序列设计SwnR基因引物,以金龟子绿僵菌cDNA为模板,高保真扩增SwnR基因,PCR产物测序结果与SwnR基因序列BLAST比对同源性为99%。2.以pUC19载体为骨架,通过无缝克隆的方法构建含有苯菌灵抗性基因的金龟子绿僵菌SwnR基因的敲除载体,SwnR上游基因序列和下游基因序列分别连在苯菌灵抗性基因的两端。经PCR和测序鉴定,成功构建载体。3.选用不同发酵时间的金... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 金龟子绿僵菌研究进展
        1.1.1 金龟子绿僵菌生物特征
        1.1.2 金龟子绿僵菌生长条件
    1.2 苦马豆素研究概况
        1.2.1 苦马豆素理化性质
        1.2.2 苦马豆素毒性机制
        1.2.3 苦马豆素药理学作用
        1.2.4 苦马豆素临床应用
        1.2.5 苦马豆素化学合成
        1.2.6 苦马豆素植物来源
        1.2.7 苦马豆素微生物来源
        1.2.8 苦马豆素生物合成通路
    1.3 真菌遗传转化研究进展
        1.3.1 真菌遗传转化的方法
        1.3.2 PEG介导的真菌遗传转化
        1.3.3 筛选标记
第二章 金龟子绿僵菌SwnR基因的敲除
    2.1 试验材料
        2.1.1 质粒和菌种
        2.1.2 试剂
        2.1.3 培养基与溶液
        2.1.4 仪器
    2.2 金龟子绿僵菌SwnR基因敲除载体的构建
        2.2.1 金龟子绿僵菌基因组DNA的提取—CTAB法
        2.2.2 金龟子绿僵菌SwnR基因的获得与测序
        2.2.3 质粒pBAR的制备
    2.3 金龟子绿僵菌SwnR基因的敲除和鉴定
        2.3.1 金龟子绿僵菌药敏试验
        2.3.2 金龟子绿僵菌原生质体的制备与转化
        2.3.3 SwnR敲除突变菌株的筛选和鉴定
    2.4 试验结果
        2.4.1 SwnR基因及进化树的构建
        2.4.2 SwnR基因敲除盒的构建
        2.4.3 苯菌灵和草铵膦敏感浓度筛选
        2.4.4 原生质体制备最佳条件筛选
        2.4.5 SwnR基因突变菌株的获得
    2.5 讨论
第三章 金龟子绿僵菌SwnR基因突变菌株功能验证
    3.1 试验材料
        3.1.1 材料
        3.1.2 试剂
        3.1.3 仪器
    3.2 金龟子绿僵菌SwnR基因缺失菌株功能验证
        3.2.1 金龟子绿僵菌野生型和突变型菌株生长速度测定
        3.2.2 金龟子绿僵菌野生型和突变型菌株发酵培养
        3.2.3 金龟子绿僵菌野生型和突变型菌株发酵产物分析前准备
        3.2.4 金龟子绿僵菌野生型和突变型菌株发酵液中苦马豆素含量的高分辨质谱仪检测
        3.2.5 金龟子绿僵菌SwnR基因突变菌株苦马豆素生物合成通路关键基因表达检测
    3.3 试验结果
        3.3.1 金龟子绿僵菌野生型和突变型菌株的表型观察结果
        3.3.2 金龟子绿僵菌野生型和突变型菌株发酵液中苦马豆素含量的高分辨质谱仪检测结果
        3.3.3 SwnR基因缺失菌株中苦马豆素生物合成通路关键基因表达检测结果
    3.4 讨论
第四章 结论
附录A
附录B
参考文献
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]真菌中环二肽及其衍生物的抗肿瘤活性研究进展[J]. 强薇,梅刚.  中国药房. 2014(21)
[2]苦马豆素人工抗原接种和田羊的免疫学研究[J]. 王帅,胡建军,陈根元,贾琦珍,马春晖,张玲.  黑龙江畜牧兽医. 2014(05)
[3]苦马豆素诱导新生SD大鼠大脑皮质神经细胞凋亡[J]. 张樑,赵宝玉,路浩,王姗姗,温伟利,周启武,王文龙.  中国兽医学报. 2014(02)
[4]不同温湿度条件下绿僵菌LA菌株对东亚飞蝗的致病力[J]. 朱彬洲,雷仲仁,徐洪富,王兆勇,梁兴慧.  中国生物防治. 2010(04)
[5]保定蝗区土壤绿僵菌对飞蝗高毒力菌株的筛选[J]. 田甜,李瑞军,陆秀君,张龙,董建臻,张振波,张怡.  植物保护. 2009(05)
[6]苦马豆素抗肿瘤作用研究进展[J]. 路浩,王建军,孙莉莎,赵宝玉,王占新,马尧,陈基萍,刘忠艳.  动物医学进展. 2009(09)
[7]金龟子绿僵菌中苦马豆素的提取[J]. 李锡杰,杨鸣琦,张伟,郭卫华,戴卉敏.  精细化工. 2009(06)
[8]生防绿僵菌研究进展[J]. 金玉荣,殷宏,罗建勋.  安徽农业科学. 2009(05)
[9]苦马豆素的抑瘤和免疫增强作用[J]. 刘巍,张晓彬,李雅,杨甫昭,谢人明.  西北药学杂志. 2006(06)
[10]金龟子绿僵菌发酵代谢产物中苦马豆素的初步研究[J]. 路宏朝,杨鸣琦,朱晓飞,何欣,李卫彬.  西北农业学报. 2006(04)

硕士论文
[1]金龟子绿僵菌中苦马豆素的提取及其对新城疫疫苗免疫效果的影响[D]. 吴延磊.西北农林科技大学 2011



本文编号：3257623