鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白亲和肽特性及相关受体功能研究

发布时间：2021-06-30 18:12

　　鸡传染性支气管炎（avian infectious bronchitis, IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。由于IBV变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异较大,在不同地区和不同时间的地方流行毒株总是以各种形式出现,所以对于IBV的分子生物学研究和与病毒入侵相关受体的研究成为一个重点。IBV纤突糖蛋白（Spike, S）是位于病毒粒子表面的结构蛋白,它既有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位,具有良好的免疫原性,又含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,是冠状病毒入侵和繁殖的关键蛋白。1.本实验成功构建了编码IBV Beaudette株S1基因的pET-S1原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行了原核表达,获得了大小为63 Ku的目的条带,使用IBV全病毒多抗进行Western blot证实所表达的蛋白为IBV S1蛋白。2.利用噬菌体随机十二肽库,以IBV S1重组蛋白为靶分子,进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物进行功能鉴定,淘选出10个噬菌体单克... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 冠状病毒基因组结构和相关蛋白研究进展
        1.1.1 冠状病毒的分类
        1.1.2 冠状病毒基因组结构特点
        1.1.3 冠状病毒基因组功能
        1.1.4 冠状病毒相关受体结构和功能
    1.2 鸡传染性支气管炎研究进展
        1.2.1 鸡传染性支气管炎的流行病学
        1.2.2 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理机制
        1.2.3 鸡传染性支气管炎的诊治
    1.3 噬菌体展示技术的研究进展
        1.3.1 噬菌体展示技术概述
        1.3.2 模拟病毒蛋白表位
        1.3.3 病毒作用机制的研究
        1.3.4 在新型疫苗研制方面的应用
    1.4 研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 菌种、载体及质粒
        2.1.3 工具酶、试剂盒和抗体试剂
        2.1.4 标准参照物
        2.1.5 实验试剂的配制
        2.1.6 仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 IBV S1基因的克隆及原核表达质粒的构建
        2.2.2 IBV S1基因的原核表达及鉴定
        2.2.3 噬菌体随机十二肽库对S1重组蛋白亲和配体的生物淘选
        2.2.4 噬菌体结合克隆的特征鉴定、序列测定及多肽合成
        2.2.5 S1蛋白亲和多肽的体外抗病毒活性检测
        2.2.6 荧光标记S1蛋白亲和多肽对IBV感染雏鸡组织内病毒的检测
        2.2.7 IBV检测方法的建立
        2.2.8 gAPN基因的克隆及原核表达
        2.2.9 gAPN重组蛋白的纯化、多抗制备及活性鉴定
        2.2.10 gAPN真核表达质粒的构建及转染
        2.2.11 S1蛋白与gAPN蛋白的亲和鉴定
        2.2.12 gAPN多克隆抗体对IBV感染CEK细胞的阻断
        2.2.13 gAPN介导IBV感染Hela细胞
        2.2.14 gAPN的生物信息学分析
3 结果
    3.1 IBV S1基因的克隆及原核表达质粒的构建
        3.1.1 IBV S1基因的RT-PCR扩增
        3.1.2 S1基因重组原核表达质粒的构建及鉴定
    3.2. S1重组蛋白的表达及鉴定
        3.2.1 S1重组蛋白的表达
        3.2.2 S1重组蛋白的Western blot鉴定
    3.3 噬菌体十二肽库对S1重组蛋白亲和配体的生物淘选
        3.3.1 S1重组蛋白的纯化
        3.3.2 噬菌体十二肽库对靶分子的四轮淘洗
        3.3.3 S1蛋白亲和多肽的抗病毒活性检测
        3.3.4 荧光标记S1蛋白亲和多肽对IBV感染雏鸡组织内病毒的检测
        3.3.5 IBV检测方法的建立
    3.4 gAPN的原核表达、多抗制备及生物学功能的研究
        3.4.1 gAPN基因的克隆
        3.4.2 gAPN基因的原核表达
        3.4.3 gAPN多克隆血清制备及生物学功能的测定
    3.5 gAPN真核表达质粒的构建和瞬时转染
        3.5.1 gAPN真核表达质粒的构建
        3.5.2 gAPN真核表达质粒的的转染
    3.6 S1蛋白与gAPN蛋白的亲和鉴定
        3.6.1 S1蛋白亲和噬菌体与gAPN蛋白的竞争ELISA
        3.6.2 S1蛋白亲和噬菌体与gAPN多抗的间接ELISA
        3.6.3 原核表达gAPN蛋白与IBV的Western blot鉴定
        3.6.4 IBV S1蛋白和gAPN蛋白的免疫共沉淀
    3.7 gAPN多克隆抗体阻断IBV感染CKE细胞
        3.7.1 gAPN多抗阻断IBV感染CEK细胞的Real-time PCR检测
        3.7.2 gAPN多克隆抗体阻断IBV感染CEK细胞的病变观察
    3.8 gAPN受体功能位点的鉴定
        3.8.1 gAPN转染Hela细胞对IBV感染的影响
        3.8.2 IBV和gAPN在BHK细胞的间接免疫荧光共定位检测
        3.8.3 gAPN表达量对IBV感染Hela细胞的影响
        3.8.4 gAPN对不同IBV毒株感染Hela细胞的影响
        3.8.5 不同长度gAPN对IBV感染Hela的影响
    3.9 gAPN的生物信息学分析
4 讨论
    4.1 IBV S1蛋白的生物学功能
    4.2 S1蛋白亲和肽的筛选及序列测定
    4.3 IBV检测方法的建立
    4.4 S1蛋白特异性标记多肽对IBV抗原分布研究
    4.5 gAPN作为IBV感染细胞功能受体的鉴定
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3258234