猪肠外致病性大肠杆菌kpsM基因缺失株构建及生物学特性研究

发布时间：2021-07-01 17:13

　　大肠杆菌（Escherichia coli）依据其遗传特性和临床表现共分为三类：共生型大肠杆菌,肠道致病性大肠杆菌以及肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli, ExPEC）。ExPEC在近些年已经成为广泛威胁全球人类和动物健康的致病菌,在人体内主要能引起肾盂肾炎和新生儿脑膜炎,在禽致病方面,主要引起败血症、气囊炎和心包炎等,在猪致病方面,主要引起脑膜炎、肺炎和败血症。因肠外致病性大肠杆菌的血清型、毒力因子、基因结构和基因表达调控的错综复杂性,对ExPEC的致病机制还没完全研究清楚。在2004-2007年间,本实验室对已分离鉴定正确的315株猪肠外致病性大肠杆菌流行病学研究中,发现其优势血清型为O11、08、O101、0138、0161、026,优势群系为B2和D群系。荚膜是覆盖在细菌表面的主要多糖结构,能够保护细菌免受宿主免疫系统的清除。2群型表达荚膜的基因组kps基因位点是由3个区域组成的一个保守性结构。kpsM是枷基因簇区域3中高度保守的一个基因位点,编码ABC转运蛋白中横跨内膜的通道蛋白。本实验室对已测序的猪肠外... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略词表(Abbreviation)
1 前言
    1.1 大肠杆菌的病原学
    1.2 大肠杆菌的流行病学及致病机制
        1.2.1 流行病学
        1.2.2 UPEC的致病机制
        1.2.3 NMEC的致病机制
    1.3 ExPEC毒力因子的概述
        1.3.1 黏附素
        1.3.2 毒素
        1.3.3 铁摄取系统
    1.4 细菌荚膜多糖的概述
2 研究目的和意义
3 材料与方法
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、质粒和培养条件
        3.1.2 动物和细胞
        3.1.3 主要药品、试剂、试剂盒与仪器
        3.1.4 主要培养基及抗生素配制
        3.1.5 主要溶液配制
        3.1.6 引物
    3.2 方法
        3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
        3.2.2 猪肠外致病性大肠杆菌的复苏增殖及基因组DNA的提取
        3.2.3 PCR扩增
        3.2.4 DNA的纯化与回收
        3.2.5 DNA与载体的连接反应
        3.2.6 连接产物的转化
        3.2.7 质粒的小量制备(碱裂解法)
        3.2.9 PCN033菌株kpsM基因前后臂片段的克隆与鉴定
        3.2.10 重组自杀性质粒pREAkpsM的构建
        3.2.11 接合转移与猪肠外致病性大肠杆菌基因缺失株的构建
        3.2.12 Southern blot
        3.2.13 猪肠外致病性大肠杆菌感受态细胞的制备
        3.2.14 猪肠外致病性大肠杆菌的电转化
        3.2.15 缺失菌株生长特性的研究
        3.2.16 缺失菌株对小鼠的毒力试验及LD_(50)的测定
        3.2.17 细胞感染试验
        3.2.18 细胞吞噬试验
        3.2.19 血清杀菌试验
        3.2.20 透射电镜观察试验
4 结果与分析
    4.1 kpsM基因生物信息学相关分析
    4.2 重组转移质粒pRE112ΔkpsM的构建与鉴定
    4.3 基因缺失突变株的筛选与鉴定
    4.4 Southern blot验证基因缺失突变株构建成功
    4.5 △kpsM互补菌株△kpsM-kpsM的构建与鉴定
    4.6 基因缺失突变株生物学特性分析
        4.6.1 遗传稳定性分析
        4.6.2 生长特性分析
    4.7 小鼠的感染试验及LD_(50)的测定
    4.8 细胞黏附试验
    4.9 细胞吞噬试验
    4.10 血清杀菌试验
    4.11 透射电镜试验
5 讨论
    5.1 kpsM基因的选定
    5.2 基因缺失突变株的构建
    5.3 透射电镜的观察结果
    5.4 kpsM基因对PCN033毒力的影响
6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验[J]. 徐引弟,王治方,朱文豪,梁跃,郭成留.  河南农业科学. 2011(01)
[2]产志贺样毒素和肠毒素大肠杆菌分子流行病学(英文)[J]. 冉雪琴,林尖兵,王嘉福.  微生物学报. 2008(06)



本文编号：3259542