FADV-4环介导等温扩增-HNB可视化检测方法的建立和应用

发布时间：2021-07-01 21:33

　　为了建立简便、快速的FADV-4环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法,试验以FADV-4高度保守的基因序列hexon基因为靶基因设计了6条引物,对反应体系的Mg²⁺浓度、Bst DNA聚合酶用量、反应温度、反应持续时间进行优化,考察了优化体系的灵敏度及特异性。同时用建立的FADV-4 LAMP及LAMP-HNB可视化的检测方法对临床模拟样品进行检测。结果表明:当Mg²⁺浓度为6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为320 U/mL、反应温度为65℃、反应时间为60 min、HNB使用浓度为120μmol/L时反应最优。LAMP最低DNA检测浓度为1.46 pg/μL,灵敏度是PCR的100倍,临床模拟样品LAMP、LAMP-HNB检测结果与普通PCR检测结果完全符合。说明所建立的FADV-4 LAMP-HNB可视化检测方法适用于临床的快速诊断。 

【文章来源】：黑龙江畜牧兽医. 2020,(24)北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

Mg2+浓度优化试验结果

不同浓度Bst DNA聚合酶反应时均显示有特异条带,且条带在40～320 U/mL范围内明显增强,但是Bst DNA聚合酶浓度为320,390 U/mL时对应的条带亮度基本一致(见图2)。为了节约试剂减少成本,因此选择Bst DNA聚合酶最佳浓度为320 U/mL。3.3 反应温度的优化

LAMP反应温度设置从60,61,62,63,64,65,66,67 ℃依次递增,反应温度为64,65,66,67 ℃时有明显拖尾的梯形条带,64 ℃时梯形条带较淡,65,66,67 ℃时条带亮度基本一致,60,61,62,63 ℃梯形条带不明显(见图3)。因此,最终选择65 ℃为最佳反应温度。3.4 反应时间的优化

【参考文献】：
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本文编号：3259906