气肿疽nanA与fliA融合基因亚单位疫苗的制备及免疫效果评价
发布时间：2021-07-02 09:30
为了制备安全且有效的气肿疽新型疫苗,控制气肿疽的暴发,本研究建立了气肿疽的原核表达载体,制备了气肿疽融合基因亚单位疫苗和单基因亚单位疫苗,并对两种疫苗的免疫水平进行了评价。本研究根据已报道的气肿疽梭菌的fliA和nanA基因设计两对特异性引物,以气肿疽梭菌基因组DNA为模板,扩增出两段大小分别为429bp的fliA基因片段和1113bp的nanA片段。利用SOE-PCR串联两个片段,在引物中加入了柔性Linker,得到大小约为1587bp的融合基因,并将该融合基因和鞭毛基因分别与pMD18-T Simple载体连接,转化至大肠杆菌感受态DH5α中,获得克隆载体fliA和pMD18-fliA-nanA。继而对克隆载体进行双酶切,获得带有黏性末端的fliA片段和fliA-nanA片段,与具有相同黏性末端的PEGX-4T-1原核表达载体进行连接,将连接后的质粒转化至大肠杆菌感受态BL21中,从而构建出了重组质粒pEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA原核表达载体。对重组质粒PEGX-4T-fliA-nanA和pEGX-4T-fliA进行双酶切鉴定、PCR鉴定、及序列测定后...
【文章来源】：延边大学吉林省 211工程院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
前言
1.1 气肿疽简介及研究进展
1.1.1 气肿疽梭菌特性
1.1.2 流行病学
1.1.3 临床症状
1.1.4 诊断
1.1.5 气肿疽的预防
1.2 气肿疽梭菌鞭毛蛋白简介
1.3 气肿疽梭菌神经氨酸酶简介
1.4 气肿疽疫苗研究进展
1.5 本研究的目的及意义
材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 实验动物
2.1.3 二抗与制备血清用试剂
2.1.4 载体及主要试剂
2.1.5 试验所需溶液
2.1.6 主要仪器及设备
2.2 方法
2.2.1 引物的设计与合成
2.2.2 气肿疽梭菌的培养
2.2.3 菌体核酸DNA提取
2.2.4 nanA基因与fliA基因的PCR扩增与拼接
2.2.5 PCR产物的纯化
2.2.6 目的基因与T载体连接
2.2.7 连接产物的转化
2.2.8 重组质粒的提取
2.2.9 重组质粒的鉴定
2.2.10 质粒的纯化回收
2.2.11 目的片段与pGEX-4T-1载体连接、转化和筛选
2.2.12 原核表达载体的鉴定
2.2.13 重组质粒的诱导表达
2.2.14 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.15 表达产物的免疫印迹分析
2.2.16 重组蛋白的大量表达
2.2.17 融合蛋白的纯化
2.2.18 接种实验动物
2.2.19 免疫动物血清分离
2.2.20 间接ELISA检测抗体水平
2.2.21 细胞因子的检测
结果
3.1 气肿疽梭菌的革兰氏染色
3.2 气肿疽梭菌的血液琼脂平板菌落
3.3 目的基因的扩增
3.4 重组质粒的PCR鉴定
3.5 重组质粒的双酶切鉴定
3.6 重组质粒的序列测定
3.7 重组表达载体的PCR鉴定
3.8 重组表达载体的酶切鉴定
3.9 表达蛋白SDS-PAGE电泳图
3.10 蛋白免疫印迹分析
3.11 蛋白存在形式鉴定
3.12 纯化蛋白鉴定
3.13 体液免疫水平检测
3.14 细胞免疫水平检测
讨论
结论
谢辞
作者简介
参考文献
【参考文献】：
期刊论文
[1]一起牛气肿疽病的诊治与体会[J]. 张龙阳,陈晓贵,许永光. 上海畜牧兽医通讯. 2014(01)
[2]利用SOE-PCR与TD-PCR技术对气肿疽梭菌FliA（C）-NanA融合基因扩增方法的构建[J]. 李香春,金鑫,朴春宇,金成德,朴春实. 安徽农业科学. 2013(24)
[3]一起羊气肿疽流行病学调查与探讨[J]. 彭红,邓贵清,李成贵,王松斌. 湖南畜牧兽医. 2013(04)
[4]黄牛气肿疽的诊治[J]. 李进. 畜禽业. 2013(08)
[5]大额牛气肿疽病的诊断与防制[J]. 何树杨,马文张. 云南畜牧兽医. 2012(06)
[6]牛气肿疽病的诊治[J]. 孙怀民,裴树坤,孙立明,张秉柱,李宏伟. 现代畜牧兽医. 2012(09)
[7]气肿疽梭菌菌体抗原分析[J]. 陈莹莹,金鑫,姜成国,娄安钢,姜丹丹,汪雪烨,邓文学,李香春. 安徽农业科学. 2012(17)
[8]一起牛气肿疽的诊治体会[J]. 刘冠辉,杨天磊,赵克平. 云南畜牧兽医. 2012(02)
[9]一起牛气肿疽病的诊疗报告[J]. 王国林. 云南畜牧兽医. 2012(01)
[10]肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性[J]. 张雪寒,何孔旺,赵攀登,栾晓婷,叶青,温立斌,李彬,王小敏,郭容利,倪艳秀,周俊明,俞正玉,茅爱华,吕立新. 江苏农业学报. 2011(05)
硕士论文
[1]气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及胶体金诊断试纸条的研制[D]. 姜丹丹.延边大学 2013
本文编号：3260212
【文章来源】：延边大学吉林省 211工程院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
前言
1.1 气肿疽简介及研究进展
1.1.1 气肿疽梭菌特性
1.1.2 流行病学
1.1.3 临床症状
1.1.4 诊断
1.1.5 气肿疽的预防
1.2 气肿疽梭菌鞭毛蛋白简介
1.3 气肿疽梭菌神经氨酸酶简介
1.4 气肿疽疫苗研究进展
1.5 本研究的目的及意义
材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 实验动物
2.1.3 二抗与制备血清用试剂
2.1.4 载体及主要试剂
2.1.5 试验所需溶液
2.1.6 主要仪器及设备
2.2 方法
2.2.1 引物的设计与合成
2.2.2 气肿疽梭菌的培养
2.2.3 菌体核酸DNA提取
2.2.4 nanA基因与fliA基因的PCR扩增与拼接
2.2.5 PCR产物的纯化
2.2.6 目的基因与T载体连接
2.2.7 连接产物的转化
2.2.8 重组质粒的提取
2.2.9 重组质粒的鉴定
2.2.10 质粒的纯化回收
2.2.11 目的片段与pGEX-4T-1载体连接、转化和筛选
2.2.12 原核表达载体的鉴定
2.2.13 重组质粒的诱导表达
2.2.14 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.15 表达产物的免疫印迹分析
2.2.16 重组蛋白的大量表达
2.2.17 融合蛋白的纯化
2.2.18 接种实验动物
2.2.19 免疫动物血清分离
2.2.20 间接ELISA检测抗体水平
2.2.21 细胞因子的检测
结果
3.1 气肿疽梭菌的革兰氏染色
3.2 气肿疽梭菌的血液琼脂平板菌落
3.3 目的基因的扩增
3.4 重组质粒的PCR鉴定
3.5 重组质粒的双酶切鉴定
3.6 重组质粒的序列测定
3.7 重组表达载体的PCR鉴定
3.8 重组表达载体的酶切鉴定
3.9 表达蛋白SDS-PAGE电泳图
3.10 蛋白免疫印迹分析
3.11 蛋白存在形式鉴定
3.12 纯化蛋白鉴定
3.13 体液免疫水平检测
3.14 细胞免疫水平检测
讨论
结论
谢辞
作者简介
参考文献
【参考文献】：
期刊论文
[1]一起牛气肿疽病的诊治与体会[J]. 张龙阳,陈晓贵,许永光. 上海畜牧兽医通讯. 2014(01)
[2]利用SOE-PCR与TD-PCR技术对气肿疽梭菌FliA（C）-NanA融合基因扩增方法的构建[J]. 李香春,金鑫,朴春宇,金成德,朴春实. 安徽农业科学. 2013(24)
[3]一起羊气肿疽流行病学调查与探讨[J]. 彭红,邓贵清,李成贵,王松斌. 湖南畜牧兽医. 2013(04)
[4]黄牛气肿疽的诊治[J]. 李进. 畜禽业. 2013(08)
[5]大额牛气肿疽病的诊断与防制[J]. 何树杨,马文张. 云南畜牧兽医. 2012(06)
[6]牛气肿疽病的诊治[J]. 孙怀民,裴树坤,孙立明,张秉柱,李宏伟. 现代畜牧兽医. 2012(09)
[7]气肿疽梭菌菌体抗原分析[J]. 陈莹莹,金鑫,姜成国,娄安钢,姜丹丹,汪雪烨,邓文学,李香春. 安徽农业科学. 2012(17)
[8]一起牛气肿疽的诊治体会[J]. 刘冠辉,杨天磊,赵克平. 云南畜牧兽医. 2012(02)
[9]一起牛气肿疽病的诊疗报告[J]. 王国林. 云南畜牧兽医. 2012(01)
[10]肠出血性大肠杆菌O157∶H7鞭毛可变区基因片段的克隆、表达与免疫原性[J]. 张雪寒,何孔旺,赵攀登,栾晓婷,叶青,温立斌,李彬,王小敏,郭容利,倪艳秀,周俊明,俞正玉,茅爱华,吕立新. 江苏农业学报. 2011(05)
硕士论文
[1]气肿疽梭菌单克隆抗体的制备及胶体金诊断试纸条的研制[D]. 姜丹丹.延边大学 2013
本文编号：3260212
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