胸膜肺炎放线杆菌五基因缺失疫苗菌株构建及生物学特性分析
发布时间：2021-07-03 04:16
猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪的接触传染性呼吸道疾病,主要引起肺的纤维性渗出、坏死性肺炎及肺膜的增厚炎性渗出,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前疫苗接种仍然是预防控制该病的主要措施,因而获取一种针对胸膜肺炎放线杆菌安全、高效、具备良好的交叉保护力的疫苗拥有极大的前景。弱毒活疫苗免疫动物后可诱导机体产生免疫力,可获得一定的对异型血清型菌的交叉保护力。主要研究内容如下。1、五基因缺失疫苗菌株构建及生物学特性的研究本研究通过接合转移和同源重组等方法在四基因缺失疫苗菌株CH04（△apxIC/△apxⅡC/△apxⅣ-orfl/△cpxAR）的基础上,进一步敲除了areA双组份基因,成功构建五基因缺失疫苗菌株YWJ05（△apxIC/△apxlIC/△apxⅣ-orfl/△cpxAR/△arcA）,生长速率结果表明：较之CH04和APP血清1型野毒（WT,下同）菌株,YWJ05菌株的生长速率下降不显著。在体外采用PK-1...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词（Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害与防治
1.1.1 病原生理生化特性
1.1.2 流行病学
1.2 疫苗研究进展
1.2.1 灭活苗
1.2.2 亚单位疫苗
1.2.3 口服疫苗
1.2.4 核酸疫苗
1.2.5 Ghosts疫苗
1.2.6 弱毒疫苗
1.3 细菌双组份调控系统研究进展
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 工具酶和试剂
3.1.3 试验动物
3.1.4 培养基及抗生素配制
3.1.5 ELISA相关溶液的配制
3.1.6 其它缓冲液及试剂
3.1.7 引物
3.2 试验方法
3.2.1 细菌的增殖及胸膜肺炎放线杆菌基因组的提取
3.2.2 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.4 质粒的小量制备
3.2.5 重组质粒的鉴定
3.2.5.1 PCR鉴定
3.2.5.2 酶切鉴定
3.2.6 突变株的构建
3.2.7 细菌RNA提取
3.2.8 DnaseⅠ消化RNA中残余的DNA
3.2.9 反转录PCR
3.2.10 突变株遗传稳定性分析
3.2.11 突变株生长特性的研究
3.2.12 细胞感染实验
3.2.12.1 细胞的培养
3.2.12.2 细胞侵入实验
3.2.12.3 细胞粘附实验
3.2.13 中性粒细胞(PMN)介导的杀菌实验
3.2.13.1 猪中性粒细胞的分离
3.2.13.2 细菌的处理
3.2.13.3 PMN杀菌实验
3.2.14 细胞吞噬试验
3.2.14.1 细胞准备
3.2.14.2 细胞吞噬试验
3.2.15 突变株毒力分析
3.2.16 淋巴细胞增殖试验(MTT)
3.2.17 全血杀菌试验
3.2.18 抗体检测分析
3.2.19 抗体分型检测
3.2.20 ELISA试剂盒检测细胞因子水平
3.2.21 突变株对小鼠的免疫保护试验
3.2.22 病理切片制备
3.2.23 统计分析
第4章 结果与分析
4.1 重组质粒构建及单交换菌株筛选
4.2 突变株的筛选和鉴定
4.3 突变株遗传稳定
4.4 突变株生长特性
4.5 细胞粘附和侵入试验
4.6 猪中性粒细胞介导杀伤试验
4.7 RAW与PAM
4.8 小鼠毒力试验
4.9 淋巴细胞增殖试验
4.10 小鼠全血杀菌试验
4.11 抗体检测试验
4.12 抗体分型检测试验
4.13 细胞因子检测
4.14 小鼠免疫保护力试验
4.15 病理切片分析
第5章 讨论
5.1 亲本菌株的选择
5.2 目的基因的选择
5.3 生物学特性分析
5.4 突变株致病力分析
5.5 突变株免疫保护效能
5.6 后续工作展望
第6章 结论
参考文献
致谢
本文编号：3261848
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词（Abbreviation)
第1章 文献综述
1.1 猪传染性胸膜肺炎的危害与防治
1.1.1 病原生理生化特性
1.1.2 流行病学
1.2 疫苗研究进展
1.2.1 灭活苗
1.2.2 亚单位疫苗
1.2.3 口服疫苗
1.2.4 核酸疫苗
1.2.5 Ghosts疫苗
1.2.6 弱毒疫苗
1.3 细菌双组份调控系统研究进展
第2章 研究目的与意义
第3章 材料与方法
3.1 试验材料
3.1.1 菌株、质粒和培养条件
3.1.2 工具酶和试剂
3.1.3 试验动物
3.1.4 培养基及抗生素配制
3.1.5 ELISA相关溶液的配制
3.1.6 其它缓冲液及试剂
3.1.7 引物
3.2 试验方法
3.2.1 细菌的增殖及胸膜肺炎放线杆菌基因组的提取
3.2.2 PCR产物或酶切产物的回收与纯化
3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.4 质粒的小量制备
3.2.5 重组质粒的鉴定
3.2.5.1 PCR鉴定
3.2.5.2 酶切鉴定
3.2.6 突变株的构建
3.2.7 细菌RNA提取
3.2.8 DnaseⅠ消化RNA中残余的DNA
3.2.9 反转录PCR
3.2.10 突变株遗传稳定性分析
3.2.11 突变株生长特性的研究
3.2.12 细胞感染实验
3.2.12.1 细胞的培养
3.2.12.2 细胞侵入实验
3.2.12.3 细胞粘附实验
3.2.13 中性粒细胞(PMN)介导的杀菌实验
3.2.13.1 猪中性粒细胞的分离
3.2.13.2 细菌的处理
3.2.13.3 PMN杀菌实验
3.2.14 细胞吞噬试验
3.2.14.1 细胞准备
3.2.14.2 细胞吞噬试验
3.2.15 突变株毒力分析
3.2.16 淋巴细胞增殖试验(MTT)
3.2.17 全血杀菌试验
3.2.18 抗体检测分析
3.2.19 抗体分型检测
3.2.20 ELISA试剂盒检测细胞因子水平
3.2.21 突变株对小鼠的免疫保护试验
3.2.22 病理切片制备
3.2.23 统计分析
第4章 结果与分析
4.1 重组质粒构建及单交换菌株筛选
4.2 突变株的筛选和鉴定
4.3 突变株遗传稳定
4.4 突变株生长特性
4.5 细胞粘附和侵入试验
4.6 猪中性粒细胞介导杀伤试验
4.7 RAW与PAM
4.8 小鼠毒力试验
4.9 淋巴细胞增殖试验
4.10 小鼠全血杀菌试验
4.11 抗体检测试验
4.12 抗体分型检测试验
4.13 细胞因子检测
4.14 小鼠免疫保护力试验
4.15 病理切片分析
第5章 讨论
5.1 亲本菌株的选择
5.2 目的基因的选择
5.3 生物学特性分析
5.4 突变株致病力分析
5.5 突变株免疫保护效能
5.6 后续工作展望
第6章 结论
参考文献
致谢
本文编号：3261848
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3261848.html
