鸡Dazl荧光报告基因追踪生殖细胞迁移和分化的研究
发布时间：2021-07-12 05:40
诱导多能干细胞（Induced Pluripotent stem Cell,iPSC）具有分化成多种类型细胞的潜能。其中iPSC在体外诱导分化成生殖细胞对于畜禽保种育种、转基因动物以及发育生物学研究具有重要的意义。Dazl是调控生殖细胞发育与分化的关键因子,是生殖细胞鉴定的主要标志物。由于Dazl在iPSC不表达,因此可以作为报告基因追踪iPSC诱导分化为生殖细胞的过程。本研究利用 CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）技术介导的同源末端连接（Homology-Mediated End Joining,HMEJ）将红色荧光蛋白基因mCherry定点敲入鸡内源Dazl基因第10个内含子处,通过Dazl启动子驱动mCherry表达,从而精确追踪内源Dazl在iPSC分化为原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）的过程中的表达情况。具体研究结果如下:（1）DAZL在鸡PGC和iPSC细胞中的表达鉴定。我们首先克隆鸡Dazl基因,制备DAZL多克隆抗体。纯...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
及生Z家族蛋白同源性分析扭engarajet欲2010)
为制作鸡ＤＡＺＬ多克隆抗体，本试验首先克隆鸡Ｄｍ／基因的编码区（Ｃｏｄｉｎｇ??ｓｅｑｕｅｎｃｅ，?ＣＤＳ），ＰＣＲ扩增得到８７０?ｂｐ片段（图１－１?），纯化回收后将它连接到ｐＥＴ－Ｂ２Ｍ??线性载体上，经测序克隆片段在第６８１?ｂｐ和７５３?ｂｐ产生无义突变（图１－２）。利用构??建好的ｐＥＴ－Ｂ２Ｍ－Ｄｍ／载体转化大肠杆菌，成功地诱导表达ＤＡＺＬ蛋白于上清，纯化??上清液中的蛋白，结果如图所示，重组蛋白分子量约为４７?ＫＤａ，纯度为８５％（图１－３）。??然后，将纯化好的蛋白免疫日本大耳兔。在日本大耳兔经过４次抗原免疫之后，抽取??其血清样本检测免疫效价。结果显示，经过免疫反应的兔血清效价超过１：?５１２０００?（图??１－４），符合抗体制备要求。而后，取经抗原免疫过的兔抗血清进行纯化，重组抗体分??子量为４７?ＫＤａ左右，抗体浓度为１０?ｍｇ／ｍｌ，纯度为９５％?（图１－５），与预期结果一致。??为验证制备的抗体具有特异性和灵敏性，我们利用纯化的ＤＡＺＬ多克隆抗体进行免??疫印迹
ｍｍ－Ｍ?Ｎ?Ｎ?Ｎ?Ｎ?＼ｖ?ｖ??图１－４兔抗血清效价图??Ｆｉｇ．?１?－４?Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ?Ｖａｌｕｅ?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?Ｒａｂｂｉｔ??２５??
本文编号：3279325
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：92 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
及生Z家族蛋白同源性分析扭engarajet欲2010)
为制作鸡ＤＡＺＬ多克隆抗体，本试验首先克隆鸡Ｄｍ／基因的编码区（Ｃｏｄｉｎｇ??ｓｅｑｕｅｎｃｅ，?ＣＤＳ），ＰＣＲ扩增得到８７０?ｂｐ片段（图１－１?），纯化回收后将它连接到ｐＥＴ－Ｂ２Ｍ??线性载体上，经测序克隆片段在第６８１?ｂｐ和７５３?ｂｐ产生无义突变（图１－２）。利用构??建好的ｐＥＴ－Ｂ２Ｍ－Ｄｍ／载体转化大肠杆菌，成功地诱导表达ＤＡＺＬ蛋白于上清，纯化??上清液中的蛋白，结果如图所示，重组蛋白分子量约为４７?ＫＤａ，纯度为８５％（图１－３）。??然后，将纯化好的蛋白免疫日本大耳兔。在日本大耳兔经过４次抗原免疫之后，抽取??其血清样本检测免疫效价。结果显示，经过免疫反应的兔血清效价超过１：?５１２０００?（图??１－４），符合抗体制备要求。而后，取经抗原免疫过的兔抗血清进行纯化，重组抗体分??子量为４７?ＫＤａ左右，抗体浓度为１０?ｍｇ／ｍｌ，纯度为９５％?（图１－５），与预期结果一致。??为验证制备的抗体具有特异性和灵敏性，我们利用纯化的ＤＡＺＬ多克隆抗体进行免??疫印迹
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本文编号：3279325
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