CRISPR/Cas9介导鸡肌肉生长和黑色素合成相关基因敲除研究
发布时间：2021-07-12 23:05
CRISPR/Cas9系统是第三代基因编辑技术,由Cas9蛋白和识别靶位点的导向RNA（guide RNA,gRNA）组成,因其靶向编辑靶基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点,得到更为广泛的应用。肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）负向调控骨骼肌生长发育,该基因缺失会导致“双肌”性状,提高产肉性能;黑素皮质素受体1基因（melanocortin 1 receptor,MC1R）、酪氨酸酶基因（tymsinase,TYR）是动物黑色素合成过程中的主要调控基因。本研究中,根据CRISPR/Cas9设计原理,针对MSTN、MC1R和TYR基因选择了4个靶位点（MT1、MT2、MC1和TY1）,构建了相应的打靶载体和报告载体,并在HEK293T细胞中验证了核酸酶活性。最终实现了鸡DF-1细胞系和鸡原代成纤维细胞的靶向基因编辑,进一步开展鸡胚注射CRISPR/Cas9生产基因修饰鸡技术方法的探索与优化。主要结果如下:1.通过CRISPR Design在线软件筛选了MSTN、MC1R和TYR三个基因的4个靶位点,采用重叠PCR方法构建打靶载体,利用引物直接退火方式构建报告载体。将...
【文章来源】：陕西理工大学陕西省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
锌指核酸酶识别靶序列的示意图
1.1.1.2 TALEN 技术TALEN 是使用类转录激活因子（Transcription activator-like effector, TALE）代替 Z作为 DNA 结合域，与 Fok I 切割结构域结合形成核酸酶。TALE 是植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）表达[12]。TALEN 由 N 端分泌信号结构域、C 端核定位结构域和 TAL重复结构域构成（图 1-2）。不同的 TALE 的 DNA 结合域由数目不同的、高度保守的重复单元串联而成，每个重复单元有 33~35 个氨基酸残基，仅第 12 和 13 位氨基酸是高度可变的，被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues, RVDs）。一个 RVD 能够识别一个碱基[13]，将多个重复序列串联起来就能够识别不同的 DNA 序列同 ZFN 相比，存在于 TALEN 中 Fok I 核酸酶同样需要二聚化才能对 DNA 进行切割，所以在构建过程中，需要在目标 DNA 中选择一定间隔的序列，TALEN 识别并结合该序列，Fok I 才有活性。
越多的这种间隔的重复序列被发现，在细菌和古生菌中存在广泛。2002 年，Mojica[20]与 Jansen[21]等将这种重复序列命名为串联间隔短回文重复序列（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR），同时根据 Cas 基因序列及蛋白结构可以将 CRISPR/Cas9 存在 3 种类型（I 型、II 型和 III 型），但不了解其功能。直到 2005 年，研究发现重复序列与外源的质粒和噬菌体高度相似，推测可能与细菌本身的免疫系统有关[22-24]。Barrangou 等[25]在 2007 年研究嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）Ⅱ型CRISPR/Cas 系统时发现，间隔序列能够识别外 DNA，而 Cas 蛋白能够获得外源间隔序列和降解噬菌体。2008 年，在大肠杆菌中，Cas 蛋白被成熟的 crRNAs 引导形成复合体，病毒增殖受到抑制，CRISPR/Cas 被证明具有免疫能力[26]。2012 年，Ⅱ型 CRISPR/Cas系统在目的 DNA 特定位点产生 DNA 双链缺口（double stranded breaks，DSB）为Ⅱ型CRISPR/Cas 系统在基因组定点编辑的应用奠定了基础[27]。随后，3 个不同类型的CRISPR/Cas 系统的具体免疫机制陆续被揭示出来[28-31]。
本文编号：3280826
【文章来源】：陕西理工大学陕西省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
锌指核酸酶识别靶序列的示意图
1.1.1.2 TALEN 技术TALEN 是使用类转录激活因子（Transcription activator-like effector, TALE）代替 Z作为 DNA 结合域，与 Fok I 切割结构域结合形成核酸酶。TALE 是植物病原体黄单胞菌（Xanthomonas）表达[12]。TALEN 由 N 端分泌信号结构域、C 端核定位结构域和 TAL重复结构域构成（图 1-2）。不同的 TALE 的 DNA 结合域由数目不同的、高度保守的重复单元串联而成，每个重复单元有 33~35 个氨基酸残基，仅第 12 和 13 位氨基酸是高度可变的，被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues, RVDs）。一个 RVD 能够识别一个碱基[13]，将多个重复序列串联起来就能够识别不同的 DNA 序列同 ZFN 相比，存在于 TALEN 中 Fok I 核酸酶同样需要二聚化才能对 DNA 进行切割，所以在构建过程中，需要在目标 DNA 中选择一定间隔的序列，TALEN 识别并结合该序列，Fok I 才有活性。
越多的这种间隔的重复序列被发现，在细菌和古生菌中存在广泛。2002 年，Mojica[20]与 Jansen[21]等将这种重复序列命名为串联间隔短回文重复序列（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR），同时根据 Cas 基因序列及蛋白结构可以将 CRISPR/Cas9 存在 3 种类型（I 型、II 型和 III 型），但不了解其功能。直到 2005 年，研究发现重复序列与外源的质粒和噬菌体高度相似，推测可能与细菌本身的免疫系统有关[22-24]。Barrangou 等[25]在 2007 年研究嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）Ⅱ型CRISPR/Cas 系统时发现，间隔序列能够识别外 DNA，而 Cas 蛋白能够获得外源间隔序列和降解噬菌体。2008 年，在大肠杆菌中，Cas 蛋白被成熟的 crRNAs 引导形成复合体，病毒增殖受到抑制，CRISPR/Cas 被证明具有免疫能力[26]。2012 年，Ⅱ型 CRISPR/Cas系统在目的 DNA 特定位点产生 DNA 双链缺口（double stranded breaks，DSB）为Ⅱ型CRISPR/Cas 系统在基因组定点编辑的应用奠定了基础[27]。随后，3 个不同类型的CRISPR/Cas 系统的具体免疫机制陆续被揭示出来[28-31]。
本文编号：3280826
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