表达PPV4的ORF2基因重组杆状病毒的构建及其免疫原性的研究

发布时间：2021-07-16 08:03

　　猪细小病毒4型（Porcine parvovirus 4, PPV4）是近年来新发现的流行病原,其主要引起猪的呼吸道和繁殖障碍性疾病。目前关于PPV4的研究主要限于流行病学和病理学方面,还没有合适的体外细胞系统用于PPV4的增殖。鉴于此,本研究以杆状病毒为载体,构建了表达PPV4的主要结构基因ORF2的重组杆状病毒,并对其免疫原性进行了研究。具体内容如下：1.PPV4 P基因的原核表达及纯化通过对PPV4 VP的抗原决定簇进行分析,将其截短为304-500aa,通过BamhⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入pET-28a原核表达载体获得重组质粒pET-28a-VP,经诱导表达后对蛋白进行复性纯化。以纯化蛋白包被ELISA酶标板,通过方阵滴定确定其最佳包被浓度,为后期小鼠动物试验免疫效果评价提供检测方法。2.表达]PPV4的VP和VP2基因的一拷贝的重组杆状病毒的构建及其免疫原性研究通过BamHI 和 HindⅢ将PPV4的VP2和VP分别克隆入pFastBac载体,获得重组转移质粒pFBD-VP2 和 BD-VP。将其转化于DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选纯化后提取杆粒,转染Sf9细胞获... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略表(Abbreviations)
1 文献综述
    1.1 病毒由来
        1.1.1 博卡病毒的由来
        1.1.2 博卡病毒的发现
    1.2 病原基本特征
    1.3 流行病学
        1.3.1 分布特点
        1.3.2 博卡病毒的年龄分布及流行季节
        1.3.3 分子流行病学
    1.4 博卡病毒的致病性与致病机理
        1.4.1 博卡病毒的致病性
        1.4.2 博卡病毒的致病机理
    1.5 杆状病毒研究进展
        1.5.1 杆状病毒的发展
    1.6 杆状病毒表达系统的研究
        1.6.1 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统概述
        1.6.2 Bac-to-Bac表达系统在疫苗研究中的应用
        1.6.3 杆状病毒表达系统表达外源蛋白的研究
2 研究目的与意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌种、细胞及毒株
        3.1.2 载体与质粒
        3.1.3 工具酶及主要试剂
        3.1.4 主要培养基的配制
        3.1.5 主要缓冲液
        3.1.6 本研究所用PCR引物
        3.1.7 试验动物及试验地点
    3.2 实验方法
        3.2.1 限制性内切酶酶切反应
        3.2.2 PCR或酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测
        3.2.3 PCR或酶切产物的回收与纯化
        3.2.4 外源DNA片段与载体的连接反应
        3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
        3.2.6 连接产物的转化
        3.2.7 重组质粒的小量制备(OMEGA质粒小提试剂盒)
        3.2.8 重组质粒的大量制备(OMEGA质粒大提试剂盒)
        3.2.9 目的蛋白的原核诱导表达
        3.2.10 包涵体提取、纯化与复性
        3.2.11 构建重组杆状病毒的操作流程
        3.2.12 重组穿梭载体(Bacmid)的构建
        3.2.13 重组穿梭载体(Bacmid)的提取
        3.2.14 重组杆状病毒的获得
        3.2.15 间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的表达
        3.2.16 Western blot检测目的蛋白的表达
        3.2.17 病毒粒子的电镜观察
        3.2.18 动物试验
        3.2.19 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-α、IFN-β、IFN-γ相对表达水平
        3.2.20 统计学方法
4 结果与分析
    4.1 PPV4的ORF2基因的截短表达及纯化
        4.1.1 pET28a-VP原核表达载体的构建
        4.1.2 VP截短蛋白的原核表达
        4.1.3 VP截短蛋白包涵体的复性
        4.1.4 间接ELISA确定截短蛋白VP的最佳包被浓度
    4.2 表达PPV4的ORF2的杆状病毒的构建及免疫效力的初步评价
        4.2.1 表达PPV4的单拷贝VP2、VP杆状病毒的构建及鉴定
        4.2.2. 表达PPV4的多拷贝VP2、VP杆状病毒的构建
        4.2.3 表达PPV4的ORF2的杆状病毒的动物试验
            4.2.3.1 重组杆状病毒免疫小鼠抗PPV4的ELISA抗体检测
            4.2.3.2 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中细胞因子mRNA表达
5 讨论
    5.1 PPV4.VP蛋白的原核表达及纯化
    5.2 表达PPV4的ORF2基因的重组杆状病毒的构建及其免疫原性研究
        5.2.1 转移载体的构建及蛋白表达
        5.2.2 病毒样颗粒VLPs的观察
        5.2.3 重组杆状病毒动物免疫效果的初步评估
6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]广州地区流感病毒和人博卡病毒感染的流行病学调查[J]. 何霞,冯发深,王铸,徐霖,张定梅,关琳琳,郑芸,周荣,曹开源.  中山大学学报(医学科学版). 2012(03)
[2]非洲猪瘟P72基因在Bac to Bac系统中的表达及抗原性鉴定[J]. 柏丽华,侯绍华,贾红,袁维峰,郭晓宇,梁欠欠,朱鸿飞.  中国畜牧兽医. 2012(03)
[3]上海嘉定地区连续3年儿童人博卡病毒感染的研究[J]. 严华杰,盛军,董蔚,管丽华,王蔚,王凯,任培君,邵洁.  临床儿科杂志. 2010(06)
[4]人博卡病毒全基因组序列测定与种系分析[J]. 修文琼,刘光华,康玉兰,沈晓娜,谢剑锋,王美爱,张文清,郑奎城.  中国人兽共患病学报. 2010(02)
[5]人博卡病毒母婴感染的临床前瞻性研究[J]. 郑敏巧,林峰,郑美云,陈弘,曾爱平,吴峰.  中华实验和临床病毒学杂志. 2007(04)
[6]猪干扰素基因研究进展及其在抗病育种中的应用展望[J]. 刘剑锋,王立贤,张沅,苏振环.  中国畜牧兽医. 2003(05)

硕士论文
[1]人博卡病毒在急性下呼吸道感染住院儿童中的现状分析[D]. 周琼华.湖南师范大学 2011
[2]猪群中三种新发小DNA病毒的分子流行病学研究[D]. 翟少伦.新疆农业大学 2010



本文编号：3286622