鸡新城疫、传染性法氏囊和传染性支气管炎病毒三重RT-PCR检测方法建立
发布时间：2021-07-17 19:48
为建立快速同步检测鸡源新城疫病毒、传染性法氏囊病毒与传染性支气管炎病毒的多重RT-PCR检测方法,并应用于临床检测。参考GenBank中NDV NP、 IBV N和IBDV VP基因序列,设计了3对特异性引物。通过优化引物浓度及退火温度建立多重RT-PCR方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,成功建立了检测NDV、 IBDV和IBV的三重RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,只扩增出NDV、 IBDV和IBV的特异性片段,对鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、鸡巴氏杆菌和鸡马立克等其他无关病原核酸无扩增;对NDV、 IBDV和IBV核酸最低检测量分别为NDV6.18×101copies/μl、 IBDV 8.64×106copies/μl和IBV2.57×102copies/μl;用该方法进行多次重复性试验结果一致。结果表明,所建立方法对NDV、 IBDV和IBV的三重RT-PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好;为鸡源新城疫、染性法氏囊与传染性支气管炎临床混合感染病例的诊断和流行病学调查提供了可靠的方法。
【文章来源】：中国畜禽种业. 2020,16(11)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
NDV退火温度优化
IBV退火温度优化
本研究参考Gen Bank中鸡新城疫、传染性法氏囊和传染性支气管炎相应靶基因的保守序列设计特异性引物。选择新城疫NP基因，传染性法氏囊VP基因，传染性支气管炎N基因作为靶序列，应用Primer Premier5.0分别设计3对特异性引物，通过NCBI BLAST比对和DNAStar软件分析确保不同引物对之间没有同源关系，不会形成稳定的引物二聚体。分别设计3个目的片段为144bp、429bp、600bp,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后大小之差约在200bp左右，使目的片段分布在Marker不同标尺大小的区域，具有辨识度，不易造成误判[21]。多重PCR技术的反应体系较常规PCR有较高的要求，们在对本研究中的每种待检病毒进行普通PCR检测成功的基础上，通过不断优化反应体系及反应程序中的退火温度，确保每一重的扩增效率保持一致，以降低引物二聚体甚至多聚体的形成。且在试验过程中选取了沙门氏菌核酸、大肠杆菌核酸、禽白血病病毒核酸以及禽支原体核酸进行特异性检测，结果均未检出这几类常见禽类病原核酸，证实了本试验建立的m PCR具有较好的特异性。同时本研究在单一RT-PCR检测方法的基础上，建立了一步法多重RT-PCR，在一个反应体系中进行反转录（RT）与聚合酶链式反应（PCR），节省了时间和操作步骤，大大提高了病原检测的效率。在本研究中，不仅可以从组织器官、排泄物、鼻腔拭子以及细胞培养物等临床样本中提取到病毒总RNA，还可以直接从血清、全血等血液样本中提取出病毒总RNA。本研究建立的一步法多重RT-PCR方法特异性强，敏感性比较高，其最低RNA检测下限达到了NDV6.18×101copies/μl、IBDV8.64×106copies/μl和IBV2.57×102copies/μl，可以用来检测血清中含量较低的NDV、IBDV和IBV，因此，本方法可以用于血清病原筛查，可应用于临床大样本量的快速检测。图5 NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR特异性优化
【参考文献】：
期刊论文
[1]多重PCR技术研究进展[J]. 钟泽澄,王进,张师音. 生物工程学报. 2020(02)
[2]鉴别四种鸭源肠道易感病原菌的多重PCR的建立[J]. 包细明,张益,鲜思美,李婷,刘良林,王现科,饶体宇,吴伯梅,张友. 中国兽医科学. 2018(12)
[3]禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用[J]. 张琳,胡北侠,杨少华,许传田,陈正涛,郝明飞,张秀美. 家畜生态学报. 2011(04)
[4]2000～2007年广西鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学[J]. 何秀苗,韦平,官丁明,阳秀英,秦爱建. 病毒学报. 2009(06)
[5]用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究[J]. 刘丽娜,何启盖,陈焕春,刘正飞,张松林,汪招雄. 中国兽医科技. 2005(02)
[6]禽流感与新城疫鉴别的诊断[J]. 湛小平,卢受昇. 肉品卫生. 2004(12)
[7]肉仔鸡非典型新城疫与肾型传支混合感染的防治[J]. 杨永刚. 中国家禽. 2004(01)
[8]ND、IB、IBD三联活疫苗[J]. 王立男. 畜牧兽医科技信息. 2001(09)
硕士论文
[1]多重聚合酶链式反应技术研究和应用[D]. 王晓囡.苏州大学 2018
本文编号：3288824
【文章来源】：中国畜禽种业. 2020,16(11)
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
NDV退火温度优化
IBV退火温度优化
本研究参考Gen Bank中鸡新城疫、传染性法氏囊和传染性支气管炎相应靶基因的保守序列设计特异性引物。选择新城疫NP基因，传染性法氏囊VP基因，传染性支气管炎N基因作为靶序列，应用Primer Premier5.0分别设计3对特异性引物，通过NCBI BLAST比对和DNAStar软件分析确保不同引物对之间没有同源关系，不会形成稳定的引物二聚体。分别设计3个目的片段为144bp、429bp、600bp,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后大小之差约在200bp左右，使目的片段分布在Marker不同标尺大小的区域，具有辨识度，不易造成误判[21]。多重PCR技术的反应体系较常规PCR有较高的要求，们在对本研究中的每种待检病毒进行普通PCR检测成功的基础上，通过不断优化反应体系及反应程序中的退火温度，确保每一重的扩增效率保持一致，以降低引物二聚体甚至多聚体的形成。且在试验过程中选取了沙门氏菌核酸、大肠杆菌核酸、禽白血病病毒核酸以及禽支原体核酸进行特异性检测，结果均未检出这几类常见禽类病原核酸，证实了本试验建立的m PCR具有较好的特异性。同时本研究在单一RT-PCR检测方法的基础上，建立了一步法多重RT-PCR，在一个反应体系中进行反转录（RT）与聚合酶链式反应（PCR），节省了时间和操作步骤，大大提高了病原检测的效率。在本研究中，不仅可以从组织器官、排泄物、鼻腔拭子以及细胞培养物等临床样本中提取到病毒总RNA，还可以直接从血清、全血等血液样本中提取出病毒总RNA。本研究建立的一步法多重RT-PCR方法特异性强，敏感性比较高，其最低RNA检测下限达到了NDV6.18×101copies/μl、IBDV8.64×106copies/μl和IBV2.57×102copies/μl，可以用来检测血清中含量较低的NDV、IBDV和IBV，因此，本方法可以用于血清病原筛查，可应用于临床大样本量的快速检测。图5 NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR特异性优化
【参考文献】：
期刊论文
[1]多重PCR技术研究进展[J]. 钟泽澄,王进,张师音. 生物工程学报. 2020(02)
[2]鉴别四种鸭源肠道易感病原菌的多重PCR的建立[J]. 包细明,张益,鲜思美,李婷,刘良林,王现科,饶体宇,吴伯梅,张友. 中国兽医科学. 2018(12)
[3]禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用[J]. 张琳,胡北侠,杨少华,许传田,陈正涛,郝明飞,张秀美. 家畜生态学报. 2011(04)
[4]2000～2007年广西鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学[J]. 何秀苗,韦平,官丁明,阳秀英,秦爱建. 病毒学报. 2009(06)
[5]用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究[J]. 刘丽娜,何启盖,陈焕春,刘正飞,张松林,汪招雄. 中国兽医科技. 2005(02)
[6]禽流感与新城疫鉴别的诊断[J]. 湛小平,卢受昇. 肉品卫生. 2004(12)
[7]肉仔鸡非典型新城疫与肾型传支混合感染的防治[J]. 杨永刚. 中国家禽. 2004(01)
[8]ND、IB、IBD三联活疫苗[J]. 王立男. 畜牧兽医科技信息. 2001(09)
硕士论文
[1]多重聚合酶链式反应技术研究和应用[D]. 王晓囡.苏州大学 2018
本文编号：3288824
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