喹噁啉类对肾上腺皮质醛固酮分泌细胞基因和蛋白质表达影响研究
发布时间：2021-07-21 13:08
喹噁啉类药物是一类人工合成的、含有喹嗯啉-1,4-二氧化物基本结构的一类化学合成抗菌药物,在提高饲料转化率、促进动物生长方面具有相当好的活性。随着该类药物的广泛使用,卡巴氧和喹乙醇已经被发现有明显的致癌、致畸、致突变、光敏和肾上腺皮质损伤等副作用。肾上腺是该类化合物主要的毒性靶器官之一,该类中大多数药物对肾上腺皮质产生损害,引起球状带分泌的醛固酮减少,造成动物机体内水盐代谢紊乱。为了阐述喹噁啉类药物对肾上腺产生毒性,及其下调醛固酮激素分泌水平,造成水盐代谢紊乱的机制,本课题以人肾上腺皮质癌细胞NCI-H295R细胞系为细胞模型,应用基因芯片,并采用蛋白质组学中经典的双向电泳和质谱分析相结合的技术为手段展开研究。本研究首先测定了喹嗯啉类药物喹烯酮和乙酰甲喹孵育H295R细胞12、24及36h时的细胞活力,结果显示,两种药物对H295R细胞的毒性均呈现出剂量依赖性和时间依赖性趋势,并且初步确定喹烯酮的细胞毒性大于乙酰甲喹的。然后在保证细胞活力的基础上,调整药物浓度,采用醛固酮ELISA检测试剂盒检测药物对H295R细胞分泌醛固酮激素的影响,结果显示,喹烯酮下调醛固酮激素分泌的能力也强于乙酰...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 喹噁啉类药物概况
1.2 喹噁啉类药物对肾上腺皮质毒性研究概况
1.2.1 醛固酮的生物合成和调控过程
1.2.2 喹噁啉类药物抑制醛固酮合成及分泌的机制研究
1.3 研究目标和内容
2 材料方法
2.1 细胞株
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 主要试剂的配制
2.5 细胞培养及冻存
2.6 细胞活力测定
2.7 醛固酮激素分泌水平检测
2.8 NCI-H295R细胞基因表达谱检测
2.8.1 样品的RNA抽提
2.8.2 RNA纯化及质控
2.8.3 样品标记
2.8.4 标记扩增后的cRNA并质检
2.8.5 芯片杂交
2.8.6 芯片洗脱
2.8.7 芯片扫描
2.8.8 数据分析
2.9 实时荧光定量PCR验证基因芯片中差异基因的mRNA表达
2.9.1 细胞总RNA提取
2.9.2 cDNA合成
2.9.3 实时荧光定量Real-time PCR
2.9.4 荧光定量数据分析
2.9.5 统计学分析
2.10 Western Blot方法验证Keap1的蛋白表达情况
2.10.1 细胞处理及分组
2.10.2 细胞蛋白提取及浓度测定
2.10.3 SDS-PAGE凝胶电泳
2.10.4 转膜
2.10.5 封闭
2.10.6 一抗孵育
2.10.7 二抗孵育
2.10.8 化学发光显色
2.11 双向电泳技术检测H295R细胞差异蛋白质组学研究
2.11.1 细胞处理及分组
2.11.2 细胞总蛋白的制备
2.11.3 蛋白质定量
2.11.4 蛋白质水化上样
2.11.5 一相等点聚焦(IEF)
2.11.6 IPG胶条平衡
2.11.7 二相SDS-PAGE电泳
2.11.8 固定
2.11.9 染色
2.11.10 图像扫描及分析
2.12 蛋白质质谱鉴定
2.12.1 胶内酶解
2.12.2 MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索
2.13 Western Blot方法验证NME1和TCP1蛋白表达情况
3 结果
3.1 喹烯酮和乙酰甲喹对H295R细胞剂量及时间依赖性毒性作用
3.2 喹烯酮和乙酰甲喹对H295R细胞分泌醛固酮激素的影响
3.3 H295R细胞基因表达谱检测
3.3.1 总RNA质量的鉴定
3.3.2 总RNA完整性的鉴定
3.3.3 芯片质量与可靠性分析
3.3.4 差异基因数量分析
3.3.5 差异基因的分类
3.4 基因芯片结果中部分差异基因的mRNA表达水平的验证
3.4.1 RNA质量的鉴定
3.4.2 部分差异基因的熔解曲线和标准曲线的图示
3.4.3 部分差异基因的mRNA水平检测
3.4.4 部分差异基因经qRT-PCR验证及芯片数据的比较结果
3.5 喹烯酮对Keap1和Nrf2蛋白表达的影响
3.6 双向电泳分离喹烯酮作NCI-H295R系细胞的总蛋白
3.6.1 考马斯亮蓝G-250结合显色法测定蛋白质含量
3.6.2 喹烯酮处理与未处理NCI-H295R细胞双向电泳图谱的建立
3.6.3 差异蛋白质点的质谱鉴定结果
3.6.4 利用STRING数据库预测蛋白质-蛋白质相互作用结果
3.6.5 Western blot技术验证双向电泳和质谱鉴定结果
4 讨论
4.1 基因芯片采取的药物作用浓度和作用时间的选择依据
4.2 喹烯酮处理H295R细胞的靶基因功能分析
4.2.1 物质合成代谢相关基因
4.2.2 胆固醇生物合成相关基因
4.2.3 醛固酮合成通路相关基因
4.2.4 调控醛固酮生物合成的相关基因
4.2.5 氧化应激相关基因
4.3 喹烯酮处理H295R细胞的差异蛋白功能分析
4.4 基因组学和蛋白质组学分析结果之间的关系
4.5 喹烯酮影响H295R细胞分泌醛固酮激素的分子机制
5 全文总结
6 文献综述：药物对肾上腺盐皮质激素影响研究进展
6.1 醛固酮的作用机制研究
6.2 醛固酮的生物合成和调控
6.2.1 醛固酮的生物合成过程
6.2.2 调控醛固酮合成的主要因素
6.3 醛固酮的分泌和调控因素
6.3.1 醛固酮的分泌
6.3.2 调控醛固酮分泌的主要因素
6.4 药物对肾上腺盐皮质激素的影响研究现状
6.4.1 与肾素-血管紧张素系统相关
6.4.2 与Ca/CaM/CaMK通路相关
6.4.3 类固醇激素合成酶抑制剂
6.4.4 醛固酮拮抗剂
6.4.5 其他
6.5 展望
参考文献
致谢
作者简介
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]盐皮质激素的非基因组作用及其机制[J]. 周海洋,肖林,陈宜张. 生理科学进展. 2008(01)
[2]喹乙醇中毒对崇仁麻鸡抗氧化功能影响的研究[J]. 郭小权,胡国良,张彩英,廖祥生. 江西农业大学学报. 2007(03)
[3]Maintaining cholesterol homeostasis: Sterol regulatory element-binding proteins[J]. Lutz W.Weber,554 Mariner Point Drive,Clinton,TN 37716,USA Meinrad Boll,Andreas Stampfl,Institute for Toxicology,GSF-National Research Center for Environment and Health,Munich,D85758 Neuherberg,Germany. World Journal of Gastroenterology. 2004(21)
[4]醛固酮与螺内酯对肝星状细胞增殖及胶原合成的影响[J]. 姚金锋,姚希贤,房红梅,崔东来,白文元. 中华医学杂志. 2003(20)
[5]猪的喹乙醇中毒[J]. 查红波,高俊. 饲料工业. 2000(03)
[6]喹乙醇在鸡体内的毒物动力学及其生化毒性和病理学研究 Ⅱ.喹乙醇对鸡的生化毒性和病理学研究[J]. 孙永学,冯淇辉,董漓波,陈杖榴. 畜牧兽医学报. 1998(06)
硕士论文
[1]喹噁啉类对肾上腺皮质醛固酮合成酶表达调控的影响[D]. 杨春辉.华中农业大学 2012
本文编号：3295081
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 喹噁啉类药物概况
1.2 喹噁啉类药物对肾上腺皮质毒性研究概况
1.2.1 醛固酮的生物合成和调控过程
1.2.2 喹噁啉类药物抑制醛固酮合成及分泌的机制研究
1.3 研究目标和内容
2 材料方法
2.1 细胞株
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 主要试剂的配制
2.5 细胞培养及冻存
2.6 细胞活力测定
2.7 醛固酮激素分泌水平检测
2.8 NCI-H295R细胞基因表达谱检测
2.8.1 样品的RNA抽提
2.8.2 RNA纯化及质控
2.8.3 样品标记
2.8.4 标记扩增后的cRNA并质检
2.8.5 芯片杂交
2.8.6 芯片洗脱
2.8.7 芯片扫描
2.8.8 数据分析
2.9 实时荧光定量PCR验证基因芯片中差异基因的mRNA表达
2.9.1 细胞总RNA提取
2.9.2 cDNA合成
2.9.3 实时荧光定量Real-time PCR
2.9.4 荧光定量数据分析
2.9.5 统计学分析
2.10 Western Blot方法验证Keap1的蛋白表达情况
2.10.1 细胞处理及分组
2.10.2 细胞蛋白提取及浓度测定
2.10.3 SDS-PAGE凝胶电泳
2.10.4 转膜
2.10.5 封闭
2.10.6 一抗孵育
2.10.7 二抗孵育
2.10.8 化学发光显色
2.11 双向电泳技术检测H295R细胞差异蛋白质组学研究
2.11.1 细胞处理及分组
2.11.2 细胞总蛋白的制备
2.11.3 蛋白质定量
2.11.4 蛋白质水化上样
2.11.5 一相等点聚焦(IEF)
2.11.6 IPG胶条平衡
2.11.7 二相SDS-PAGE电泳
2.11.8 固定
2.11.9 染色
2.11.10 图像扫描及分析
2.12 蛋白质质谱鉴定
2.12.1 胶内酶解
2.12.2 MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索
2.13 Western Blot方法验证NME1和TCP1蛋白表达情况
3 结果
3.1 喹烯酮和乙酰甲喹对H295R细胞剂量及时间依赖性毒性作用
3.2 喹烯酮和乙酰甲喹对H295R细胞分泌醛固酮激素的影响
3.3 H295R细胞基因表达谱检测
3.3.1 总RNA质量的鉴定
3.3.2 总RNA完整性的鉴定
3.3.3 芯片质量与可靠性分析
3.3.4 差异基因数量分析
3.3.5 差异基因的分类
3.4 基因芯片结果中部分差异基因的mRNA表达水平的验证
3.4.1 RNA质量的鉴定
3.4.2 部分差异基因的熔解曲线和标准曲线的图示
3.4.3 部分差异基因的mRNA水平检测
3.4.4 部分差异基因经qRT-PCR验证及芯片数据的比较结果
3.5 喹烯酮对Keap1和Nrf2蛋白表达的影响
3.6 双向电泳分离喹烯酮作NCI-H295R系细胞的总蛋白
3.6.1 考马斯亮蓝G-250结合显色法测定蛋白质含量
3.6.2 喹烯酮处理与未处理NCI-H295R细胞双向电泳图谱的建立
3.6.3 差异蛋白质点的质谱鉴定结果
3.6.4 利用STRING数据库预测蛋白质-蛋白质相互作用结果
3.6.5 Western blot技术验证双向电泳和质谱鉴定结果
4 讨论
4.1 基因芯片采取的药物作用浓度和作用时间的选择依据
4.2 喹烯酮处理H295R细胞的靶基因功能分析
4.2.1 物质合成代谢相关基因
4.2.2 胆固醇生物合成相关基因
4.2.3 醛固酮合成通路相关基因
4.2.4 调控醛固酮生物合成的相关基因
4.2.5 氧化应激相关基因
4.3 喹烯酮处理H295R细胞的差异蛋白功能分析
4.4 基因组学和蛋白质组学分析结果之间的关系
4.5 喹烯酮影响H295R细胞分泌醛固酮激素的分子机制
5 全文总结
6 文献综述：药物对肾上腺盐皮质激素影响研究进展
6.1 醛固酮的作用机制研究
6.2 醛固酮的生物合成和调控
6.2.1 醛固酮的生物合成过程
6.2.2 调控醛固酮合成的主要因素
6.3 醛固酮的分泌和调控因素
6.3.1 醛固酮的分泌
6.3.2 调控醛固酮分泌的主要因素
6.4 药物对肾上腺盐皮质激素的影响研究现状
6.4.1 与肾素-血管紧张素系统相关
6.4.2 与Ca/CaM/CaMK通路相关
6.4.3 类固醇激素合成酶抑制剂
6.4.4 醛固酮拮抗剂
6.4.5 其他
6.5 展望
参考文献
致谢
作者简介
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]盐皮质激素的非基因组作用及其机制[J]. 周海洋,肖林,陈宜张. 生理科学进展. 2008(01)
[2]喹乙醇中毒对崇仁麻鸡抗氧化功能影响的研究[J]. 郭小权,胡国良,张彩英,廖祥生. 江西农业大学学报. 2007(03)
[3]Maintaining cholesterol homeostasis: Sterol regulatory element-binding proteins[J]. Lutz W.Weber,554 Mariner Point Drive,Clinton,TN 37716,USA Meinrad Boll,Andreas Stampfl,Institute for Toxicology,GSF-National Research Center for Environment and Health,Munich,D85758 Neuherberg,Germany. World Journal of Gastroenterology. 2004(21)
[4]醛固酮与螺内酯对肝星状细胞增殖及胶原合成的影响[J]. 姚金锋,姚希贤,房红梅,崔东来,白文元. 中华医学杂志. 2003(20)
[5]猪的喹乙醇中毒[J]. 查红波,高俊. 饲料工业. 2000(03)
[6]喹乙醇在鸡体内的毒物动力学及其生化毒性和病理学研究 Ⅱ.喹乙醇对鸡的生化毒性和病理学研究[J]. 孙永学,冯淇辉,董漓波,陈杖榴. 畜牧兽医学报. 1998(06)
硕士论文
[1]喹噁啉类对肾上腺皮质醛固酮合成酶表达调控的影响[D]. 杨春辉.华中农业大学 2012
本文编号：3295081
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3295081.html
