核仁因子Def在斑马鱼肝脏部分切除后伤口无疤修复中的功能研究

发布时间：2021-07-23 00:51

　　后口动物肝脏具有强大的再生能力,肝脏部分切除后虽不能恢复成原本的形态,但其质量经代偿生长可达到术前相仿的水平。伤口完整修复且不留疤也是肝脏切除或移植手术后肝脏再生的重要特征。先前大量研究结果显示多条信号通路参与调控再生中激活肝细胞重新增殖的过程,然而有关调控术后肝脏切口处无疤修复的分子机制目前鲜有报道。消化器官生长因子（Digestive-organ-expansion-factor, Def）是一个核仁蛋白,最近研究结果表明该蛋白与Calpain3形成复合物,能够介导核仁内p53蛋白的降解。基于成年斑马鱼肝脏在部分肝脏切除后两周内能够再生这一实验模型,我们试图探索Def-Capn3-p53该通路在斑马鱼肝脏再生中的作用。首先,我们发现正常情况下成年defhi429/+突变体肝脏中Def的表达量只有野生型的1/4。其次,成年野生型斑马鱼术后肝脏中Def表达量明显增加,表明Def蛋白可能在斑马鱼肝脏再生中具有一定的作用,尽管defhi429/+突变体术后肝脏中Def表达量也有所增加,但增加量远低于野生型。随后,我们比较了野生型和defhi429/+突变体术后肝脏的再生情况,发现尽管def... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：118 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
    1.1 哺乳动物肝脏再生的生物学特征
    1.2 哺乳动物肝脏再生与信号通路
        1.2.1 启动阶段
        1.2.2 增殖阶段
        1.2.3 终止阶段
    1.3 斑马鱼的肝脏结构与功能
    1.4 斑马鱼肝脏再生及其研究进展
    1.5 基因def及其研究进展
    1.6 本研究的内容、目的与意义
第二章 材料与方法
    2.1 斑马鱼品系及饲养
    2.2 常规生化试剂及配方
    2.3 DNA相关实验方法
        2.3.1 基因的克隆
        2.3.2 DNA测序
        2.3.3 PCR鉴定转基因鱼及突变体
    2.4 RNA相关实验方法
        2.4.1 总RNA的提取
        2.4.2 总RNA中基因组DNA的消化
        2.4.3 两步法RT-PCR
        2.4.4 Northern杂交
        2.4.5 转录组RNA测序(RNA seq)
    2.5 蛋白质相关实验方法
        2.5.1 mu-Leg1多抗制备
        2.5.2 蛋白质免疫印迹杂交(Western Blotting)
        2.5.3 抗体免疫荧光染色
    2.6 组织原位杂交相关实验方法
        2.6.1 肝脏组织切片的制备
        2.6.2 Masson染色
        2.6.3 HE染色
        2.6.4 PAS染色
        2.6.5 EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷)的标记及检测
    2.7 斑马鱼的操作
        2.7.1 肝脏部分切除手术(Partial Hepatectomy,PH)
        2.7.2 肝重/体重比值(Liver-to-Body Ratio,LBR)的测量
        2.7.3 小分子药物的处理
    2.8 斑马鱼显微注射
    2.9 mu-leg1基因条件性剔除小鼠模型的建立
    2.10 Western强度及荧光强度的定量
    2.11 本研究涉及的列表
第三章 def~(hi429/+)突变体部分肝脏切除后切口处再生缺陷
    3.1 def~(hi429/+)成年斑马鱼肝脏中Def单倍剂量表达不足
    3.2 def~(hi429/+)突变体部分肝脏切除后切口处再生缺陷
    3.3 def~(hi429/+)突变体部分肝脏切除后LBR值和肝组织结构未显异常
第四章 def~(hi429/+)突变体部分肝脏切除后伤口形成疤痕
    4.1 def~(hi429/+)突变体术后早期细胞增殖或凋亡无异常
    4.2 def~(hi429/+)突变体术后肝脏伤口无法正常重塑
    4.3 def~(hi429/+)突变体术后伤口纤维化
第五章 def~(hi429/+)突变体术后伤口处结疤与异常的炎症反应有关
    5.1 def~(hi429/+)突变体术后肝脏切口处TGFβ信号异常
    5.2 def~(hi429/+)突变体肝脏伤口处胶原蛋白沉积与活性氧化物信号无关
    5.3 def~(hi429/+)突变体肝脏术后伤口处TGFβ信号异常源于过度的炎症反应
    5.4 def~(hi429/+)突变体肝脏内促炎症因子异常表达
    5.5 def~(hi429/+)突变体肝脏术后炎症细胞行为紊乱
第六章 def~(hi429/+)突变体术后切口处结疤依赖于Def-p53信号通路
    6.1 def~(hi429/+)突变体术后结疤源于肝细胞中Def单倍剂量表达不足
    6.2 def~(hi429/+)突变体术后切口结疤依赖于p53信号通路的持续激活
第七章 def~(hi429/+)突变体术后结疤与HMGB1表达上调有关
    7.1 def~(hi429/+)突变体肝脏中HMGB1表达上调
    7.2 def~(hi429/+)突变体术后伤疤的形成依赖于HMGB1
第八章 肝脏再生细胞的来源
    8.1 斑马鱼部分肝脏切除后切口处再生肝细胞具有肝前体细胞特性
    8.2 斑马鱼部分肝脏切除后非切口处再生肝细胞的来源
    8.3 Tg(fabp10a:CreER~(T2)转基因斑马鱼的构建及表达分析
第九章 斑马MJegl复系同源基因在小鼠中的表达谱分析及mu-legl基因敲除
    9.1 小鼠mu-leg1基因克隆与序列分析
    9.2 基因mu-leg1组织表达谱分析
    9.3 mu-Leg1多抗的制备
    9.4 mu-Leg1组织表达谱分析
    9.5 mu-leg1基因条件性剔除小鼠模型的建立
第十章 结论与讨论
    10.1 结论
    10.2 讨论
参考文献
作者简介
致谢



本文编号：3298250