猪APOA2和SEPW1基因的转录调控分析

发布时间：2021-07-23 10:54

　　猪,是我们获取动物蛋白质的主要来源。猪肉品质好坏直接影响着口感。随着生活水平的提高,人们对猪肉品质的要求也有所提高。因此,通过分子育种的方法改善猪的肉质性状是当前比较热门的一项研究课题。为此,我们在分子水平上对猪的脂肪相关基因APOA2和肌肉相关基因SEPW1进行了相关性研究,主要集中在基因的启动子区域进行转录调控分析。所得的结果如下所述：（1）猪APOA2和SEPW1基因在猪不同组织中表达情况的研究。主要采用实时定量PCR的方法进行检测,并建立了组织表达谱。结果为：猪APOA2基因主要在肝脏中表达,并且表达量很高；在脂肪中也有微量的表达;在其它组织中表达量极低,可忽略不计。猪SEPW1基因在各个组织中均有不同程度的表达,而在心脏和腓肠肌组织中表达量最高,在脾脏中表达量最低。（2）猪APOA2和SEPW1基因5’侧翼调控序列的克隆。我们参照NCBI上提供的基因5’侧翼调控序列进行引物设计,以猪基因组DNA为模板,克隆了猪APOA2基因1919bp和SEPW1基因1993bp的序列。序列克隆结果与NCBI上提供的序列进行比对,相似度均达到99%。（3）猪SEPW1基因启动子CpG岛甲基化... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
常用中英文縮略词表
第一章 文献综述
    1 前言
    2 真核生物启动子的研究进展
        2.1 真核生物启动子的结构
        2.2 真核生物启动子的转录调控
    3 启动子的预测和研究方法
        3.1 启动子的预测技术
        3.2 启动子的研究方法
    4 DNA甲基化的研究
        4.1 DNA甲基化的作用
        4.2 DNA甲基化的检测方法
    5 APOA2基因的研究进展
    6 SEPW1基因的研究进展
    7 研究的目的和意义
第二章 实验材料和方法
    1 试验材料
        1.1 主要的生化试剂和药品
        1.2 细胞、菌株和载体及猪基因组DNA
        1.3 试剂盒
        1.4 主要的仪器、设备及耗材
        1.5 缓冲液和常用试剂的配制
        1.6 组织表达谱分析的样品
        1.7 DNA甲基化分析的样品
        1.8 主要的生物学软件和网站
    2 试验方法
        2.1 猪不同组织总RNA的提取及cDNA的合成
            2.1.1 利用TRIzol试剂同时从猪的不同组织中提取RNA,具体步骤如下
            2.1.2 cDNA的合成
            2.1.3 猪APOA2和SEPW1基因的组织表达谱
        2.2 猪APOA2和SEPW1基因5’侧翼序列的克隆和分析
            2.2.1 基因5’侧翼调控序列的扩增
            2.2.2 扩增产物的检测及回收
            2.2.3 pMD-18T载体的连接
            2.2.4 感受态的制备和连接产物的转化
            2.2.5 阳性克隆的筛选及测序
            2.2.6 小量提取含目的片段的pMD18-T载体的质粒
        2.3 猪APOA2和SEPW1基因近端启动子缺失分析
            2.3.1 猪APOA2和SEPW1基因近端启动子生物信息学分析
            2.3.2 基因5’侧翼调控序列缺失载体的构建
            2.3.3 转染细胞并进行双荧光素酶报告基因检测
            2.3.4 进一步缺失分析寻找转录因子结合位点
            2.3.5 定点突变试验
            2.3.6 转录因子超表达试验
            2.3.7 转录因子SP1的siRNA干扰试验
        2.4 启动子区域的甲基化研究
            2.4.1 猪组织DNA的提取
            2.4.2 DNA亚硫酸氢盐处理
            2.4.3 PCR扩增、克隆及测序
第三章 实验结果与分析
    1 猪APOA2基因的转录调控分析
        1.1 猪APOA2基因组织表达谱分析
        1.2 猪APOA2基因5’侧翼调控序列的克隆和分析
        1.3 猪APA02基因5’侧翼调控序列的生物信息学分析
        1.4 猪APOA2基因5’侧翼调控序列的缺失载体的构建
        1.5 猪APOA2基因启动子缺失重组表达载体的活性分析
        1.6 进一步缺失分析以寻求转录因子结合位点
        1.7 点突变的验证试验
    2 猪SEPW1基因的转录调控分析
        2.1 猪SEPW1基因组织表达谱分析
        2.2 猪SEPW1基因5侧翼调控序列的克隆和分析
        2.3 猪SEPW1基因5'侧翼调控序列的生物信息学分析
        2.4 猪SEPW1基因5'侧翼调控序列缺失载体的构建
        2.5 猪SEPW1基因启动子缺失重组表达载体的活性分析
        2.6 进一步缺失分析以寻找转录因子结合位点
        2.7 点突变的验证试验
        2.8 超表达验证试验
        2.9 siRNA干扰试验
            2.9.1 实时荧光定量PCR检测干扰的效果
            2.9.2 荧光活性检测
        2.10 猪SEPW1基因启动子区域CpG岛甲基化分析
            2.10.1 猪SEPW1基因部分区域CpG岛预测
            2.10.2 包含CpG岛的片段扩增
            2.10.3 CpG岛甲基化的情况分析
            2.10.4 甲基化与基因表达量的相关分析
            2.10.5 肌肉组织在不同时期和不同猪种中的甲基化情况分析
第四章 讨论
    1 猪APOA2基因转录调控的分析讨论
        1.1 猪APOA2基因的组织表达情况分析讨论
        1.2 猪APOA2基因启动子分析讨论
        1.3 关于转录因子GATA1的分析讨论
    2 猪SEPW1基因转录调控的分析讨论
        2.1 猪SEPW1基因的组织表达情况分析讨论
        2.2 猪SEPW1基因启动子分析讨论
        2.3 关于转录因子SP1的分析讨论
第五章 小结
    1 本研究的主要结果
    2 下一步的工作计划
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]真核生物启动子的鉴定方法[J]. 石慧,李建远.  中外医学研究. 2012(08)
[2]DNA甲基化及其与个体年龄相关性研究[J]. 徐隆昌,易少华,黄代新,杨庆恩.  中国法医学杂志. 2011(04)
[3]真核生物启动子的研究及应用[J]. 黄玉,杨波,迟小华,刘丽宏,李薇,卢学春.  生物技术通讯. 2010(02)
[4]转录因子概述[J]. 张艳馥,沙伟.  生物学教学. 2009(10)
[5]真核生物启动子的预测技术[J]. 孙吉贵,韩霄松,卢欣华,行荣,仲洋.  计算机科学. 2009(01)
[6]猪分子育种技术及其发展趋势[J]. 庞有志,杨再.  黑龙江畜牧兽医. 2006(12)
[7]RNAi技术综述[J]. 吴锦银.  现代医院. 2006(12)
[8]RNAi技术的研究进展和发展前景[J]. 李成,张滨丽,李杰.  东北农业大学学报. 2005(03)
[9]真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的计算机预测[J]. 姚凤霞,张瑞芳,刘春宇,夏家辉,夏昆.  国外医学.遗传学分册. 2005(01)
[10]定点突变技术的研究进展[J]. 张浩,毛秉智.  免疫学杂志. 2000(S1)



本文编号：3299158