恩诺沙星胶体金试纸条初步研制
发布时间：2021-07-26 16:18
试验一,通过活化酯法将小分子的恩诺沙星（EFLX）偶联到牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）上,形成偶联物EFLX-BSA和EFLX-OVA,以EFLX-BSA为免疫原试验小鼠,以EFLX-OVA为检测原通过ELISA方法检测小鼠的血清效价,以及Ci-ELISA检测抗体的特异性和最低检测限。结果表明,免疫原和检测原均成功合成,血清效价检测结果是,第一组为25600,第二组和第三组均大于51200,第二组最高;间接竞争ELISA法结果表明,所获多克隆抗体对EFLX特异性强,最低检出限为 1.17 ng/mL,IC50值为 54.60 ng/mL,检测范围为 7.39 ng/mL～403.43 ng/mL。试验二,制备抗恩诺沙星的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。采用活化酯法合成恩诺沙星-牛血清白蛋白作为免疫原免疫小鼠,利用杂交瘤细胞技术建立杂交瘤细胞株,利用体内诱生法制备单克隆抗体,然后对制备的单抗的效价、敏感性、特异性、亲和力和亚型等免疫学特性进行鉴定。获得细胞株7C5,对单抗亚型鉴定结果均为IgG1,诱生腹水中抗体的效价在1.035×10-6以上,最低检出限为0.56 n...
【文章来源】：江西农业大学江西省
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１氟喹诺酮类药物结构通式??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ??
以及ＬＣ基因片段。设计引物时，两种抗体库的??上游引物相同，均根据抗体骨架区ＦＲ１或者引导序列的保守区５’端序列设计；下游??引物不同，ＳｃＦｖ库从铰链区（Ｊ区）的保守序列设计１５８＊６１１，Ｆａｂ抗体库从恒定序列中??设计。抗体的可变区序列中，５’端开始为前导序列，ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３和ＦＲ４为保守??序列，ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３为高变区（图１）。??ＦＲ１?Ｃ．ＤＲ１?ＦＲ２?ＣＤＲ２?ＦＲ３?ＣＤＲ３?ＦＲ４??愁签爵細?Ｌ?．二－ｄ????????图２抗体可变区基因示意图??Ｆｉｇ．２?ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｇｅｎｅ?ｖａｒｉａｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ??２．３抗体的筛选??所谓噬菌体抗体库的筛选，简而言之，就是通过一定的免疫学方法，通过数次的??“吸附一洗脱一扩增”，最终使表达了目的基因片段的特异性克隆蛋白得以富集１６２，６３］。??根据能否获得纯化的抗原，抗体的筛选的方法主要分为两个方面（图２）。??２．３．１纯化抗原的筛选??固相化抗原筛选法是用纯化后的抗原包被在固相介质上，比如酶标板、免疫试管、??亲和柱等上，表达了特异性抗体的噬菌体能针对抗原表位特异性结合，从而被筛选出??来。此种方法也是目前采用最多的方法之一｜６４］。抗原液相筛选法是将抗原标记生物素??后，利用链亲和素磁珠借助磁场作用力进行噬菌体筛选的一种方法，Ｌａｂｒｉｇｎ等１６５１用??此方法对膜蛋白噬菌体库成功进行了筛眩??２．３．２非纯化抗原的筛选??２．３．２．１细胞筛选法??某些抗原存在难以纯化或抗原＋可知性问题，细胞筛选解决了这些难题。比如??Ｓｈａｄｉｄｉ等Ｉ６６１用白血病细
ｍｌ?ＰＢＳ??（ｐＨ?７．４），另称取１８ｍｇ?ＯＶＡ溶于３ｍＬ?ＰＢＳ?（ｐＨ?７．４），得此溶液为Ｂ液。将上述反??应液Ａ?（过夜处理）逐滴加入Ｂ中，要求每１０？１５?ｍｉｎ加入２００（ｉＬ，１．５ｈ内操作完??毕。合成后完全抗原置入透析袋中，在盛有ＰＢＳ液的烧杯中磁力搅拌器条件下透析??７２?ｈ，每１２?ｈ换液一次。收集合成的抗原，如有沉淀离心机１０００?ｒｐｍ条件下离心５?ｍｉｎ??后取上清，用此法对偶联抗原进行初步纯化。偶联抗原合成原理见图５。??〇??。力８?Ａ??图４恩诺沙星结构式??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ??１２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]盐酸克伦特罗快速检测胶体金试纸的研制[J]. 肖治理,余建华,雷红涛,杨金易,孙远明. 现代食品科技. 2013(08)
[2]氯霉素胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[J]. 肖治理,曾文亮,王弘,沈玉栋,孙远明,杨金易. 食品与机械. 2013(04)
[3]一种快速检测氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡——配合胶体金试纸卡读数仪使用[J]. 马寅生,万宇平,刘清珺,贾芳芳,张禹,杜美红. 生物技术通报. 2013(06)
[4]超高效液相色谱-串联质谱同时快速检测生鲜牛乳中的磺胺类和氟喹诺酮类药物[J]. 曲斌,陆桂萍,蒋天梅,耿士伟,朱志谦,吴玲. 江苏农业科学. 2013(06)
[5]噬菌体Bp7尾丝蛋白gp35、gp38对噬菌体增殖的影响[J]. 颜晨,逯凯,张灿,刘文华,邹玲,任慧英. 中国兽医学报. 2013(05)
[6]免疫亲和柱净化/高效液相色谱法同时测定动物源性食品中16种磺胺类药物残留[J]. 袁中珍,张雷,唐柏彬,郗存显,王国民,游丽娜,赵华. 分析测试学报. 2013(04)
[7]定向偶联制备三肽囊素人工抗原及其多克隆抗体的研制[J]. 邓舜洲,冷闯,张文波,许昌满,胡杨,邹柳,邬向东,谌南辉,朱芝秀. 江西农业大学学报. 2013(01)
[8]鸡沙门菌恩诺沙星耐药性风险评估[J]. 李乾学,王大成,吴永魁,夏志平,邓旭明. 中国兽医学报. 2013(02)
[9]克伦特罗和莱克多巴胺多残留胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 姜金庆,杨雪峰,王自良,邓瑞广,王选年,张改平. 畜牧兽医学报. 2013(01)
[10]恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体的制备[J]. 邹晓楠,龚云飞,奚茜,李沐洁,张晓峰,方结红,陈宗伦,王唯芬,张明洲. 安徽农业科学. 2012(27)
博士论文
[1]三种鼠传疾病快速检测胶体金试纸条的研制[D]. 浦昀.吉林大学 2011
[2]禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究[D]. 彭伏虎.华中农业大学 2008
硕士论文
[1]恩诺沙星免疫快速检测技术研究[D]. 邹晓楠.中国计量学院 2013
[2]奶牛孕酮半定量检测胶体金试纸条的研制[D]. 李志源.天津农学院 2012
[3]氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立[D]. 孙勇.南京农业大学 2012
[4]氯霉素胶体金试纸条的研制[D]. 陈发荣.南昌大学 2011
[5]莱克多巴胺胶体金试纸条的研制及生产线设计[D]. 高鹏.南昌大学 2011
[6]恩诺沙星时间分辨荧光免疫和纳米均相荧光免疫技术的建立与考核[D]. 赵莉莉.江南大学 2011
[7]抗氯霉素单克隆抗体的制备及化学发光酶免疫分析方法的建立[D]. 钟寒燕.南昌大学 2010
[8]达氟沙星、加替沙星、特布他林残留的酶联免疫测定法的建立[D]. 刘中秋.山东大学 2009
[9]抗Amp单抗的制备及牛奶中Amp残留胶体金免疫层析检测方法的研究[D]. 张鸿.南昌大学 2008
[10]促黄体素单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 崔贞亮.西北农林科技大学 2007
本文编号：3303902
【文章来源】：江西农业大学江西省
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１氟喹诺酮类药物结构通式??Ｆｉｇ．?１?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ??
以及ＬＣ基因片段。设计引物时，两种抗体库的??上游引物相同，均根据抗体骨架区ＦＲ１或者引导序列的保守区５’端序列设计；下游??引物不同，ＳｃＦｖ库从铰链区（Ｊ区）的保守序列设计１５８＊６１１，Ｆａｂ抗体库从恒定序列中??设计。抗体的可变区序列中，５’端开始为前导序列，ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３和ＦＲ４为保守??序列，ＣＤＲ１、ＣＤＲ２和ＣＤＲ３为高变区（图１）。??ＦＲ１?Ｃ．ＤＲ１?ＦＲ２?ＣＤＲ２?ＦＲ３?ＣＤＲ３?ＦＲ４??愁签爵細?Ｌ?．二－ｄ????????图２抗体可变区基因示意图??Ｆｉｇ．２?ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?Ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｇｅｎｅ?ｖａｒｉａｂｌｅ?ｒｅｇｉｏｎ??２．３抗体的筛选??所谓噬菌体抗体库的筛选，简而言之，就是通过一定的免疫学方法，通过数次的??“吸附一洗脱一扩增”，最终使表达了目的基因片段的特异性克隆蛋白得以富集１６２，６３］。??根据能否获得纯化的抗原，抗体的筛选的方法主要分为两个方面（图２）。??２．３．１纯化抗原的筛选??固相化抗原筛选法是用纯化后的抗原包被在固相介质上，比如酶标板、免疫试管、??亲和柱等上，表达了特异性抗体的噬菌体能针对抗原表位特异性结合，从而被筛选出??来。此种方法也是目前采用最多的方法之一｜６４］。抗原液相筛选法是将抗原标记生物素??后，利用链亲和素磁珠借助磁场作用力进行噬菌体筛选的一种方法，Ｌａｂｒｉｇｎ等１６５１用??此方法对膜蛋白噬菌体库成功进行了筛眩??２．３．２非纯化抗原的筛选??２．３．２．１细胞筛选法??某些抗原存在难以纯化或抗原＋可知性问题，细胞筛选解决了这些难题。比如??Ｓｈａｄｉｄｉ等Ｉ６６１用白血病细
ｍｌ?ＰＢＳ??（ｐＨ?７．４），另称取１８ｍｇ?ＯＶＡ溶于３ｍＬ?ＰＢＳ?（ｐＨ?７．４），得此溶液为Ｂ液。将上述反??应液Ａ?（过夜处理）逐滴加入Ｂ中，要求每１０？１５?ｍｉｎ加入２００（ｉＬ，１．５ｈ内操作完??毕。合成后完全抗原置入透析袋中，在盛有ＰＢＳ液的烧杯中磁力搅拌器条件下透析??７２?ｈ，每１２?ｈ换液一次。收集合成的抗原，如有沉淀离心机１０００?ｒｐｍ条件下离心５?ｍｉｎ??后取上清，用此法对偶联抗原进行初步纯化。偶联抗原合成原理见图５。??〇??。力８?Ａ??图４恩诺沙星结构式??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｅｎｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ??１２??
【参考文献】：
期刊论文
[1]盐酸克伦特罗快速检测胶体金试纸的研制[J]. 肖治理,余建华,雷红涛,杨金易,孙远明. 现代食品科技. 2013(08)
[2]氯霉素胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[J]. 肖治理,曾文亮,王弘,沈玉栋,孙远明,杨金易. 食品与机械. 2013(04)
[3]一种快速检测氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡——配合胶体金试纸卡读数仪使用[J]. 马寅生,万宇平,刘清珺,贾芳芳,张禹,杜美红. 生物技术通报. 2013(06)
[4]超高效液相色谱-串联质谱同时快速检测生鲜牛乳中的磺胺类和氟喹诺酮类药物[J]. 曲斌,陆桂萍,蒋天梅,耿士伟,朱志谦,吴玲. 江苏农业科学. 2013(06)
[5]噬菌体Bp7尾丝蛋白gp35、gp38对噬菌体增殖的影响[J]. 颜晨,逯凯,张灿,刘文华,邹玲,任慧英. 中国兽医学报. 2013(05)
[6]免疫亲和柱净化/高效液相色谱法同时测定动物源性食品中16种磺胺类药物残留[J]. 袁中珍,张雷,唐柏彬,郗存显,王国民,游丽娜,赵华. 分析测试学报. 2013(04)
[7]定向偶联制备三肽囊素人工抗原及其多克隆抗体的研制[J]. 邓舜洲,冷闯,张文波,许昌满,胡杨,邹柳,邬向东,谌南辉,朱芝秀. 江西农业大学学报. 2013(01)
[8]鸡沙门菌恩诺沙星耐药性风险评估[J]. 李乾学,王大成,吴永魁,夏志平,邓旭明. 中国兽医学报. 2013(02)
[9]克伦特罗和莱克多巴胺多残留胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 姜金庆,杨雪峰,王自良,邓瑞广,王选年,张改平. 畜牧兽医学报. 2013(01)
[10]恩诺沙星人工抗原及多克隆抗体的制备[J]. 邹晓楠,龚云飞,奚茜,李沐洁,张晓峰,方结红,陈宗伦,王唯芬,张明洲. 安徽农业科学. 2012(27)
博士论文
[1]三种鼠传疾病快速检测胶体金试纸条的研制[D]. 浦昀.吉林大学 2011
[2]禽流感与新城疫胶体金免疫层析快速检测技术及初步应用研究[D]. 彭伏虎.华中农业大学 2008
硕士论文
[1]恩诺沙星免疫快速检测技术研究[D]. 邹晓楠.中国计量学院 2013
[2]奶牛孕酮半定量检测胶体金试纸条的研制[D]. 李志源.天津农学院 2012
[3]氯霉素单克隆抗体的制备以及胶体金快速诊断方法的初步建立[D]. 孙勇.南京农业大学 2012
[4]氯霉素胶体金试纸条的研制[D]. 陈发荣.南昌大学 2011
[5]莱克多巴胺胶体金试纸条的研制及生产线设计[D]. 高鹏.南昌大学 2011
[6]恩诺沙星时间分辨荧光免疫和纳米均相荧光免疫技术的建立与考核[D]. 赵莉莉.江南大学 2011
[7]抗氯霉素单克隆抗体的制备及化学发光酶免疫分析方法的建立[D]. 钟寒燕.南昌大学 2010
[8]达氟沙星、加替沙星、特布他林残留的酶联免疫测定法的建立[D]. 刘中秋.山东大学 2009
[9]抗Amp单抗的制备及牛奶中Amp残留胶体金免疫层析检测方法的研究[D]. 张鸿.南昌大学 2008
[10]促黄体素单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 崔贞亮.西北农林科技大学 2007
本文编号：3303902
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