调控miR-10a表达的转录因子鉴定及其在PRRSV感染过程中的功能初探

发布时间：2021-07-26 17:34

　　猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus,PRRSV）引起,在全球养猪生产中最重要的烈性传染病之一。该病的主要特征是生产母猪的繁殖障碍表现为流产、死胎、木乃伊胎,以及仔猪呼吸系统疾病。因PRRSV的抗原具有高突变性、以及病毒的持续感染等特征,至今仍没有开发出完全有效的商业疫苗,难以对该病进行有效的预防和治疗。因此,宿主本身对抗PRRSV的研究变得至关重要,既能深入剖析PRRSV感染后的致病机制,又为进一步的疫苗开发提供理论指导。microRNAs（miRNAs）是一类可以在转录后水平调控基因表达的非编码小RNA,目前大量的研究表明,miRNAs能够靶向病毒基因组或宿主基因来影响病毒的复制。我们前期的研究结果表明,猪肺泡巨噬细胞（PAMs）的宿主源microRNA miR-10a能够显著抑制PRRSV在PAMs中的复制,并证明了miR-10a是通过特异性抑制其下游靶基因SRP14的翻译来抑制PRRSV复制的。但miR-10a的转录调控机制仍不清楚,为了阐明这一... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒与miR-10a的研究进展
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展
        1.1.1 PRRSV的病毒学特征
        1.1.2 PRRSV的致病机理
        1.1.3 PRRSV的防控现状
    1.2 .microRNAs的研究进展
        1.2.1 microRNAs的发现及加工合成机制
        1.2.2 microRNA的作用机制
        1.2.3 microRNA靶基因的预测及鉴定
        1.2.4 microRNAs在病毒感染中的作用
        1.2.5 microRNAs对宿主免疫系统的调控
        1.2.6 microRNAs在PRRSV感染中的研究
        1.2.7 miR-10a的研究进展
第二章 猪源miR-10a启动子区的克隆及其核心启动子区的鉴定
    2.1 试验材料
        2.1.1 细胞和载体
        2.1.2 主要实验试剂及耗材
        2.1.3 主要实验设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 猪源miR-10a启动子区的预测及引物设计
        2.2.2 猪肺泡巨噬细胞(PAMs)的分离冻存及基因组的提取
        2.2.3 构建猪源miR-10a启动子区的双荧光素酶报告质粒
        2.2.4 双荧光素酶活性报告检测启动子区的活性
        2.2.5 猪源miR-10a启动子区第一次梯度截短报告载体的构建
        2.2.6 miR-10a启动子区第一次梯度截短报告载体的荧光素酶活性检测
        2.2.7 猪源miR-10a启动子区第二次梯度截短报告载体的构建
        2.2.8 miR-10a启动子区第二次梯度截短报告载体的荧光素酶活性检测
        2.2.9 猪源miR-10a启动子区第三次梯度截短报告载体的构建
        2.2.10 miR-10a启动子区第三次梯度截短报告载体的荧光素酶活性检测
    2.3 实验结果
        2.3.1 猪源miR-10a启动子区的预测
        2.3.2 猪源miR-10a启动子区报告质粒的构建
        2.3.3 猪源miR-10a启动子区荧光素酶活性检测
        2.3.4 猪源miR-10a启动子区第一次梯度截短荧光素酶活性检测结果
        2.3.5 猪源miR-10a启动子区第二次梯度截短荧光素酶活性检测结果
        2.3.6 猪源miR-10a启动子区第三次梯度截短荧光素酶活性检测结果
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 猪源miR-10转录因子的预测分析及鉴定
    3.1 试验材料
        3.1.1 细胞、病毒和载体
        3.1.2 主要试验试剂和耗材
        3.1.3 主要实验设备
        3.1.4 qRT-PCR检测引物
    3.2 试验方法
        3.2.1 生物信息学软件预测
        3.2.2 转录因子结合位点突变荧光素酶报告重组质粒的构建
        3.2.3 转录因子结合位点突变报告质粒的荧光素酶活性检测
        3.2.4 PAMs细胞的复苏及铺板
        3.2.5 BAY11-7082预处理PAMs细胞
        3.2.6 PAMs细胞接毒
        3.2.7 细胞总RNA提取及反转录
        3.2.8 荧光定量PCR
        3.2.9 上清样品中病毒的滴度测定
        3.2.10 Western blot检测蛋白水平的表达
        3.2.11 慢病毒介导的过表达SRP14细胞株的构建
    3.3 实验结果
        3.3.1 转录因子结合位点预测分析
        3.3.2 突变转录因子结合位点后荧光素酶活性检测
        3.3.3 NF-κB与负调控miR-10a对PRRSV的抑制作用
        3.3.4 SRP14促进PRRSV的复制
    3.4 讨论
    3.5 小结
全文总结
参考文献
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]miRNAs as new molecular insights into inflammatory bowel disease: Crucial regulators in autoimmunity and inflammation[J]. Xiao-Min Xu,Hong-Jie Zhang.  World Journal of Gastroenterology. 2016(07)
[2]应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA的动态表达[J]. 杨红波,梁巍,刘新星,朱作言,林硕,张博.  遗传. 2012(09)



本文编号：3304025