流行性乙型脑炎病毒prM蛋白furin蛋白酶剪切位点突变分析及稳定表达细胞系的构建

发布时间：2021-07-27 04:40

　　流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）是亚洲地区最为严重的流行性脑炎，是一种人兽共患性急性传染病。该病严重威胁人类健康，同时对养殖业造成巨大危害。该病目前没有特异治疗方法，疫苗免疫是预防控制该病的有效措施。传统灭活疫苗和弱毒疫苗具有良好的免疫原性，在预防和控制乙型脑炎的历史中发挥了重要作用。但是基于JEV全病毒制造的灭活疫苗成本高且有副作用，减毒活疫苗免疫原性好但也存在潜在的安全问题。因此人们将目光投向了寻求更安全有效的新型疫苗研究开发中。研究表明，哺乳动物细胞表达的JEV M和E蛋白能够组装成病毒样颗粒（VLP），其在诱导机体产生中和抗体和免疫保护力上同JEV病毒粒子有着相似的能力，而且病毒样颗粒不含病毒核酸物质，有极高的安全性。通过构建真核表达细胞系产生VLP，是制备JE理想候选疫苗的策略之一。但黄病毒膜蛋白对表达细胞有毒性作用，使建立稳定表达VLP的细胞系存在障碍。研究表明这种毒性作用是由E蛋白与细胞膜的融合作用引起的，而prM蛋白的剪切影响着JEV病毒粒子的成熟以及病毒粒子与细胞的结合与融合。本研究试图通过改变prM的剪切位点来抑制表达JEV VLP... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：47 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

prM蛋白剪切位点氨基酸突变及引物示意图

320 倍稀释； JEV病毒液室温下融化，5 000 rpm 离心 5 min，将病毒上清稀释成释的血清与病毒液混合按体积比1:1 充分混合摇匀，置与 37 ℃温毕后，迅速将病毒一血清混合物以及对照组的血清接种于 24 孔L； 5% CO2 培养箱培养， 6 h 后每孔加入 600 μL 含 3%羧甲基纤3 天后倒掉细胞培养液，PBS 洗涤后加入含 0.1%结晶紫的甲醛固果增电泳对 PCR 扩增产物进行分析，经多次实验改进反应条件后，一致，pr 片段的大小为 350 bp 和突变后的 M-E 片段大小为 170pr M12 3 45

中国农业科学院硕士学位论文 第二章 稳定表达细胞系的构建2.3.2 重组质粒的酶切鉴定将 pr 基因片段分别与五种不同的 M-E 基因片段连接到长度约 7 000 bp 的真核表达载体pCAG-neo 中，该载体上含有在真核细胞内表达所需要的操控元件和用于筛选的抗性基因，重组质粒经 Sca I 单酶切得到 9 000 bp 的片段，经 Sac I 与 Xho I 双酶切鉴定得到 7 000 bp 和 2 100 bp的 DNA 片段，与预期相符合（图 2-2）。进一步测序证实扩增所得目的片段的核酸序列符合设计要求的突变结果。prM(ΔR89)EprM(ΔR91)E prM(R89A)EprM(R91A)E prM(R92A)E

【参考文献】：
期刊论文
[1]稳定表达乙型脑炎病毒NS1蛋白细胞系的建立[J]. 陈振师,刘立科,汪恩强,李业南,华荣虹.  中国预防兽医学报. 2011(12)
[2]流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[J]. 赵付荣,华荣虹,王斌,陈娜莎,阿合买提·买买提,步志高.  中国兽医杂志. 2010(01)



本文编号：3305098