核因子I/A（NFIA）依赖其N末端的DNA结合结构域抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）复制
发布时间：2021-07-28 16:00
猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）严重危害世界养猪业,目前仍无有效防控策略,因此探究宿主内源性蛋白拮抗PRRSV的分子机理意义重大。前期试验发现核因子I/A（nuclear factor I/A,NFIA）可以有效抑制PRRSV复制,故本试验以非洲绿猴胚胎肾细胞Marc-145细胞为模型,对NFIA抑制PRRSV复制的分子机理进行了深入探究。首先,构建NFIA的N末端DNA结合结构域缺失质粒pcDNA3.1-Flag-ΔN和C末端转录激活结构域缺失质粒pcDNA3.1-Flag-ΔC并分别转染Marc-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后用qRT-PCR和Western blot的试验方法分别检测病毒N蛋白的RNA和蛋白表达水平。结果显示ΔC仍能有效降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,但ΔN则不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,这表明NFIA的N末端结构域是抑制病毒的关键。其次,对NFIA全长质粒pcDNA3.1-Flag-WT进行N末端结构域内不同功能位...
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(06)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
缺失C末端结构域(ΔC)的NFIA仍能抑制PRRSV的RNA和蛋白表达
查阅文献发现NFI蛋白的N末端结构域具有二聚化、DNA结合以及促进腺病毒复制等多项重要功能,而针对该结构域的几个重要功能位点进行2个连续氨基酸的定点突变可以分别破坏其功能[14]。由此,针对NFIA的N末端结构域内几个不同功能位点分别在pcDNA3.1-Flag-WT质粒上进行双碱基突变,依次破坏掉野生型NFIA基因的促腺病毒复制功能(Mut1,YR86～87WL)、DNA结合功能(Mut2,LR119～120VD)和二聚化功能(Mut3,LF135～136VD)(图5)。通过在线引物设计工具NEBaseChangerTM设计3对背靠背引物并由生工合成,利用Q5定点突变试剂盒分别构建定点突变质粒pcDNA3.1-Flag-Mut1、pcDNA3.1-Flag-Mut2和pcDNA3.1-Flag-Mut3,测序验证无误后去内毒素提取质粒。分别按照200,400,800 ng/孔的浓度转染Mut1到Marc-145细胞进行浓度梯度过表达,另外转染空载体pcDNA3.1-Flag作为阴性对照,转染pcDNA3.1-Flag-WT作为阳性对照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收获细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记试验分别检测病毒ORF7 mRNA及N蛋白表达水平,发现相比空载体,Mut1仍能下调PRRSV的RNA和蛋白表达水平,并存在剂量依赖(图6)。
为确认NFIA在Marc-145细胞中对PRRSV复制的影响,分别进行了浓度梯度的NFIA过表达和抑制表达试验:分别按照200,400,800 ng/孔的浓度转染pcDNA3.1-Flag-WT到Marc-145细胞,并转染空载体pcDNA3.1-Flag作为对照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收获细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记试验分别检测病毒ORF7 mRNA及N蛋白表达水平,发现过表达NFIA能显著抑制PRRSV的RNA和蛋白表达,并且存在剂量依赖(图1)。分别按照10,20,40 nmol/L的浓度转染si-NFIA到Marc-145细胞,并转染非特异性siRNA作阴性对照(negative control,NC),24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收获细胞,分别检测病毒ORF7 mRNA及N蛋白表达水平,发现抑制NFIA表达会提高PRRSV的RNA和蛋白表达量,且存在剂量依赖(图2)。图2 抑制NFIA表达能增强PRRSV的RNA和蛋白表达
本文编号：3308213
【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(06)北大核心CSCD
【文章页数】：9 页
【部分图文】：
缺失C末端结构域(ΔC)的NFIA仍能抑制PRRSV的RNA和蛋白表达
查阅文献发现NFI蛋白的N末端结构域具有二聚化、DNA结合以及促进腺病毒复制等多项重要功能,而针对该结构域的几个重要功能位点进行2个连续氨基酸的定点突变可以分别破坏其功能[14]。由此,针对NFIA的N末端结构域内几个不同功能位点分别在pcDNA3.1-Flag-WT质粒上进行双碱基突变,依次破坏掉野生型NFIA基因的促腺病毒复制功能(Mut1,YR86～87WL)、DNA结合功能(Mut2,LR119～120VD)和二聚化功能(Mut3,LF135～136VD)(图5)。通过在线引物设计工具NEBaseChangerTM设计3对背靠背引物并由生工合成,利用Q5定点突变试剂盒分别构建定点突变质粒pcDNA3.1-Flag-Mut1、pcDNA3.1-Flag-Mut2和pcDNA3.1-Flag-Mut3,测序验证无误后去内毒素提取质粒。分别按照200,400,800 ng/孔的浓度转染Mut1到Marc-145细胞进行浓度梯度过表达,另外转染空载体pcDNA3.1-Flag作为阴性对照,转染pcDNA3.1-Flag-WT作为阳性对照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收获细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记试验分别检测病毒ORF7 mRNA及N蛋白表达水平,发现相比空载体,Mut1仍能下调PRRSV的RNA和蛋白表达水平,并存在剂量依赖(图6)。
为确认NFIA在Marc-145细胞中对PRRSV复制的影响,分别进行了浓度梯度的NFIA过表达和抑制表达试验:分别按照200,400,800 ng/孔的浓度转染pcDNA3.1-Flag-WT到Marc-145细胞,并转染空载体pcDNA3.1-Flag作为对照,24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收获细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记试验分别检测病毒ORF7 mRNA及N蛋白表达水平,发现过表达NFIA能显著抑制PRRSV的RNA和蛋白表达,并且存在剂量依赖(图1)。分别按照10,20,40 nmol/L的浓度转染si-NFIA到Marc-145细胞,并转染非特异性siRNA作阴性对照(negative control,NC),24 h后感染PRRSV(MOI=1),48 h后收获细胞,分别检测病毒ORF7 mRNA及N蛋白表达水平,发现抑制NFIA表达会提高PRRSV的RNA和蛋白表达量,且存在剂量依赖(图2)。图2 抑制NFIA表达能增强PRRSV的RNA和蛋白表达
本文编号：3308213
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