猪肺炎支原体表面膜蛋白的原核表达及免疫原性分析
发布时间：2021-08-02 12:01
猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS）又称猪气喘病,是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, MHP）引起的,感染猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性呼吸道传染病。猪群在感染MHP后,很容易继发感染其他病原,增’加了猪病诊断和预防控制的难度。此外,MPS会导致感染猪群的饲料转化率降低,增重减缓,严重危害全球养猪业的发展。同其他传染病的防治一样,MPS的控制也主要采取免疫接种的方式。目前预防MPS的商用疫苗主要是常规灭活疫苗和弱毒疫苗。但是猪肺炎支原体的培养条件苛刻,制备灭活疫苗或弱毒疫苗的成本相对较高。因此,迫切需要研制出更为安全、高效、廉价的新型疫苗。挖掘猪肺炎支原体抗原蛋白,是开发新型猪肺炎支原体疫苗的关键。猪肺炎支原体的细胞膜在其致病过程中发挥着重要作用,而目前MHP的膜蛋白中有很大部分蛋白的功能是未知的。鉴于此,本课题以猪肺炎支原体为研究对象,对其膜蛋白中具有免疫原性的蛋白进行了筛选,旨在找到猪肺炎支原体的免疫优势蛋白,从而为开发亚单位疫苗和建立诊断方法奠定基础。具体研究内容如下：1.候选蛋白的确定运用生物信...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
縮略语表（ABBREVIATION)
第一章 文献综述
1.1 猪肺炎支原体概述
1.2 猪肺炎支原体致病机理
1.3 猪肺炎支原体粘附因子研究进展
1.3.1 粘附蛋白P97
1.3.2 粘附蛋白P102
1.3.3 P159蛋白
1.3.4 P216蛋白
1.3.5 Mhp271蛋白
1.3.6 P116蛋白
1.3.7 Mhp107蛋白
1.3.8 Mhp684(P146)蛋白
1.4 猪肺炎支原体其他抗原蛋白的研究进展
1.4.1 细胞质蛋白P36
1.4.2 细胞膜表面抗原蛋白P46
1.4.3 细胞膜表面脂蛋白P65
1.4.4 热休克蛋白DnaK
1.4.5 NrdF蛋白
1.4.6 Mhp366蛋白
1.4.7 Mhp378蛋白和Mhp651蛋白
1.5 猪肺炎支原体疫苗研究进展
1.5.1 常规灭活疫苗
1.5.2 常规弱毒疫苗
1.5.3 基因工程疫苗的研究进展
1.6 猪支原体肺炎的综合防制
第二章 研究目的和意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 质粒和载体
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 培养基和抗生素及其配制
3.1.5 主要缓冲液和试剂及其配制
3.1.6 实验动物
3.1.7 主要实验仪器及设备
3.2 实验方法
3.2.0 猪肺炎支原体的培养
3.2.1 支原体基因组DNA的提取
3.2.2 候选蛋白基因的PCR扩增及密码子SOE-PCR突变
3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.6 连接产物的转化
3.2.7 重组质粒的酶切鉴定及测序
3.2.8 重组蛋白的原核表达和SDS-PAGE分析
3.2.9 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
3.2.10 原核表达重组蛋白的纯化
3.2.11 间接ELISA分析纯化的候选蛋白的反应原性
3.2.12 小鼠实验检测候选蛋白的免疫原性
第四章 结果与分析
4.1 候选研究蛋白的选取
4.2 候选蛋白基因扩增
4.3 候选蛋白原核表达载体构建
4.4 重组候选蛋白的原核表达
4.4.1 全长候选蛋白表达
4.4.2 去N端跨膜区序列的候选蛋白的原核表达
4.5 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
4.5.1 MHP感染猪血清中大肠杆菌抗体的中和
4.5.2 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
4.5.3 Western Blot进一步验证初步筛选得到的候选蛋白
4.6 重组候选蛋白的纯化
4.7 候选蛋白与MHP感染阳性猪血清的反应原性分析
4.7.1 间接ELISA检测候选蛋白与MHP感染猪血清的反应
4.7.2 间接ELISA分析候选蛋白与疫苗免疫不同时间的猪血清的反应
4.8 候选蛋白的免疫原性分析
4.8.1 候选蛋白作抗原检测候选蛋白免疫的小鼠的ELISA抗体水平
4.8.2 MHP菌体蛋白作抗原检测候选蛋白免疫小鼠的ELISA抗体水平
4.8.3 MHP全菌蛋白作抗原Western Blot检测候选蛋白免疫鼠血清
第五章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 候选蛋白的选择
5.1.2 候选蛋白的原核表达
5.1.3 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
5.1.4 候选蛋白的纯化
5.1.5 候选蛋白的免疫特性分析
5.2 结论
参考文献
附录1 PCR扩增引物
附录2 SOE-PCR定点突变突变引物
附录3 去N端跨膜区引物
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答[J]. 马丰英,姚睿玉,邹浩勇,刘新军,何启盖. 中国兽医学报. 2012(04)
[2]猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立[J]. 刘茂军,丁志勇,刘冬霞,杜海霞,缪芬芳,甘源,孔猛,冯志新,熊祺琰,白方方,杜改梅,邵国青. 金陵科技学院学报. 2011(04)
[3]表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组猪霍乱沙门氏菌对小鼠的免疫原性[J]. 马丰英,邹浩勇,何启盖. 微生物学报. 2011(09)
[4]猪肺炎支原体P36蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 祝永琴,冯志新,刘茂军,吴叙苏,邵国青. 江苏农业学报. 2010(05)
[5]猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备[J]. 冯志新,迟灵芝,刘茂军,王海燕,甘源,吴叙苏,邵国青. 江苏农业学报. 2010(02)
[6]猪肺炎支原体p97 R1区基因和大肠杆菌LTB基因的重组和表达[J]. 卢会英,沈青春,宁宜宝. 中国兽医杂志. 2010(04)
[7]猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备[J]. 曹培丽,李媛,陈超,郭丹,辛九庆,李继昌. 中国预防兽医学报. 2009(07)
[8]猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析[J]. 李媛,张建华,王亮,乔祖建,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2008(03)
[9]猪肺炎支原体乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立[J]. 姚睿玉,何启盖,周锐,陈焕春. 中国兽医学报. 2007(04)
[10]猪肺炎支原体的分子生物学研究进展[J]. 邵国青,蔡宝祥. 中国人兽共患病杂志. 1999(02)
本文编号：3317529
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
縮略语表（ABBREVIATION)
第一章 文献综述
1.1 猪肺炎支原体概述
1.2 猪肺炎支原体致病机理
1.3 猪肺炎支原体粘附因子研究进展
1.3.1 粘附蛋白P97
1.3.2 粘附蛋白P102
1.3.3 P159蛋白
1.3.4 P216蛋白
1.3.5 Mhp271蛋白
1.3.6 P116蛋白
1.3.7 Mhp107蛋白
1.3.8 Mhp684(P146)蛋白
1.4 猪肺炎支原体其他抗原蛋白的研究进展
1.4.1 细胞质蛋白P36
1.4.2 细胞膜表面抗原蛋白P46
1.4.3 细胞膜表面脂蛋白P65
1.4.4 热休克蛋白DnaK
1.4.5 NrdF蛋白
1.4.6 Mhp366蛋白
1.4.7 Mhp378蛋白和Mhp651蛋白
1.5 猪肺炎支原体疫苗研究进展
1.5.1 常规灭活疫苗
1.5.2 常规弱毒疫苗
1.5.3 基因工程疫苗的研究进展
1.6 猪支原体肺炎的综合防制
第二章 研究目的和意义
第三章 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 菌株
3.1.2 质粒和载体
3.1.3 工具酶及主要试剂
3.1.4 培养基和抗生素及其配制
3.1.5 主要缓冲液和试剂及其配制
3.1.6 实验动物
3.1.7 主要实验仪器及设备
3.2 实验方法
3.2.0 猪肺炎支原体的培养
3.2.1 支原体基因组DNA的提取
3.2.2 候选蛋白基因的PCR扩增及密码子SOE-PCR突变
3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化
3.2.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
3.2.6 连接产物的转化
3.2.7 重组质粒的酶切鉴定及测序
3.2.8 重组蛋白的原核表达和SDS-PAGE分析
3.2.9 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
3.2.10 原核表达重组蛋白的纯化
3.2.11 间接ELISA分析纯化的候选蛋白的反应原性
3.2.12 小鼠实验检测候选蛋白的免疫原性
第四章 结果与分析
4.1 候选研究蛋白的选取
4.2 候选蛋白基因扩增
4.3 候选蛋白原核表达载体构建
4.4 重组候选蛋白的原核表达
4.4.1 全长候选蛋白表达
4.4.2 去N端跨膜区序列的候选蛋白的原核表达
4.5 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
4.5.1 MHP感染猪血清中大肠杆菌抗体的中和
4.5.2 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
4.5.3 Western Blot进一步验证初步筛选得到的候选蛋白
4.6 重组候选蛋白的纯化
4.7 候选蛋白与MHP感染阳性猪血清的反应原性分析
4.7.1 间接ELISA检测候选蛋白与MHP感染猪血清的反应
4.7.2 间接ELISA分析候选蛋白与疫苗免疫不同时间的猪血清的反应
4.8 候选蛋白的免疫原性分析
4.8.1 候选蛋白作抗原检测候选蛋白免疫的小鼠的ELISA抗体水平
4.8.2 MHP菌体蛋白作抗原检测候选蛋白免疫小鼠的ELISA抗体水平
4.8.3 MHP全菌蛋白作抗原Western Blot检测候选蛋白免疫鼠血清
第五章 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 候选蛋白的选择
5.1.2 候选蛋白的原核表达
5.1.3 菌落原位免疫印迹初步筛选候选蛋白
5.1.4 候选蛋白的纯化
5.1.5 候选蛋白的免疫特性分析
5.2 结论
参考文献
附录1 PCR扩增引物
附录2 SOE-PCR定点突变突变引物
附录3 去N端跨膜区引物
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答[J]. 马丰英,姚睿玉,邹浩勇,刘新军,何启盖. 中国兽医学报. 2012(04)
[2]猪肺炎支原体DnaK基因的表达及ELISA方法建立[J]. 刘茂军,丁志勇,刘冬霞,杜海霞,缪芬芳,甘源,孔猛,冯志新,熊祺琰,白方方,杜改梅,邵国青. 金陵科技学院学报. 2011(04)
[3]表达猪肺炎支原体免疫原性基因的重组猪霍乱沙门氏菌对小鼠的免疫原性[J]. 马丰英,邹浩勇,何启盖. 微生物学报. 2011(09)
[4]猪肺炎支原体P36蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 祝永琴,冯志新,刘茂军,吴叙苏,邵国青. 江苏农业学报. 2010(05)
[5]猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体制备[J]. 冯志新,迟灵芝,刘茂军,王海燕,甘源,吴叙苏,邵国青. 江苏农业学报. 2010(02)
[6]猪肺炎支原体p97 R1区基因和大肠杆菌LTB基因的重组和表达[J]. 卢会英,沈青春,宁宜宝. 中国兽医杂志. 2010(04)
[7]猪肺炎支原体P52蛋白的原核表达及抗血清制备[J]. 曹培丽,李媛,陈超,郭丹,辛九庆,李继昌. 中国预防兽医学报. 2009(07)
[8]猪肺炎支原体中国分离株热休克蛋白Hsp70（Dnak）的全基因克隆及C末端基因的表达与免疫活性分析[J]. 李媛,张建华,王亮,乔祖建,辛九庆. 中国预防兽医学报. 2008(03)
[9]猪肺炎支原体乳酸脱氢酶基因的克隆、表达、纯化及其间接ELISA检测方法的建立[J]. 姚睿玉,何启盖,周锐,陈焕春. 中国兽医学报. 2007(04)
[10]猪肺炎支原体的分子生物学研究进展[J]. 邵国青,蔡宝祥. 中国人兽共患病杂志. 1999(02)
本文编号：3317529
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