CYP3A29基因在猪支原体肺炎发生过程中的作用研究

发布时间：2021-08-04 05:29

　　细胞色素P450酶（CYP）是一种能够氧化多种底物的血红素硫氢酸盐类酶,在类固醇类物质合成、前致癌剂激活、药物代谢等方面发挥重要作用,最新研究表明细胞色素P450酶也参与炎症反应。CYP3A29是猪CYP3A亚家族的主要功能酶。猪支原体肺炎是由肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病,本课题组前期研究发现猪CYP3A29基因表达与肺炎支原体感染引发的炎症反应关系密切。目的：通过构建稳定表达CYP3A29基因的猪肺泡巨噬细胞系,探讨CYP3A29基因在肺炎支原体感染炎症反应过程的作用。方法：RT-PCR获取猪CYP3A29基因序列,目的片段与pMD18-T目连,得到pMD18-T-CYP3A29重组质粒并测序验证,用Xhol和NotI对重组质粒及pcDNA3.1（+）/zeo进行双酶切,分别获取线性DNA片段,用T4DNA连接酶将二者连接,构建重组真核表达载体pcDNA3.1（+）/zeo-CYP3 A29,并对其进行双酶切验证,扩增阳性克隆,提取质粒,并以脂质体2000将其转染至猪肺泡巨噬细胞系3D4/21,zeocin抗性筛选后,RT-PCR及Wesrern-blot鉴定基因表达。猪肺炎... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：100 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
第一部分 文献综述
    第一章 猪支原体肺炎和CYP3A29基因研究进展
        1 猪支原体肺炎研究进展
            1.1 病原
            1.2 流行病学
            1.3 临床症状
            1.4 猪肺炎支原体的黏附与致病机理
            1.5 宿主及免疫炎症反应
        2 细胞色素P450酶和CYP3A29基因研究进展
            2.1 细胞色素P450酶概述
            2.2 猪细胞色素P450酶家族
                2.2.1 CYP1家族
                2.2.2 CYP2家族
                2.2.3 CYP3家族
            2.3 CYP3A29基因研究进展
                2.3.1 CYP3A29基因的组织分布
                2.3.2 CYP3A29基因的表达和代谢特点
                2.3.3 CYP3A29基因的结构特点
    第二章 相关炎性细胞因子和PPAR-γ受体
        1 细胞因子与炎症反应
            1.1 肿瘤坏死因子
            1.2 白细胞介素-1
            1.3 白细胞介素-6
            1.4 白细胞介素-8
        2 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)
            2.1 PPARs作用模式
            2.2 PPAR-γ相关转导途径
            2.3 PPAR-γ与炎症发生相关作用机制
第二部分 实验研究
    第一章 稳定表达猪CYP3A29基因的PAM细胞系构建及鉴定
        1 实验材料
            1.1 实验样品
            1.2 实验材料
                1.2.1 主要仪器设备
                1.2.2 主要药品、试剂及相关溶液配制
                1.2.3 细胞、菌种及载体
        2 实验方法
            2.1 克隆载体的构建
                2.1.1 引物设计及合成
                2.1.2 肝脏总RNA提取
                2.1.3 RNA浓度、纯度及完整性的鉴定
                2.1.4 目的基因的反转录
                2.1.5 PCR扩增
                2.1.6 PCR产物的电泳鉴定、纯化及浓度测定
                2.1.7 PCR产物胶回收的片段与pMD18-T载体的连接
                2.1.8 转化感受态细菌
                2.1.9 阳性克隆的筛选和鉴定
            2.2 真核表达载体的构建
                2.2.1 目的片段和载体的制备
                2.2.2 目的片段和真核表达载体的连接
                2.2.3 重组质粒转化感受态细胞
                2.2.4 菌液PCR、测序验证转化效果
                2.2.5 无内毒素质粒提取
                2.2.6 重组真核表达载体的双酶切验证
            2.3 重组真核表达载体转染PAM细胞
                2.3.1 猪肺泡巨噬细胞的复苏
                2.3.2 猪肺泡巨噬细胞的传代
                2.3.3 猪肺泡巨噬细胞的冻存
                2.3.4 最佳zeocin筛选浓度的确定
                2.3.5 制备不同浓度的DNA-Lipofectmine-2000复合物
                2.3.6 转染PAM细胞
                2.3.7 zeocin抗性筛选稳定表达细胞系与扩大培养
                2.3.8 转染效果的鉴定
                2.3.9 稳定转染细胞的保存
        3 结果
            3.1 总RNA鉴定结果
            3.2 猪CYP3A29基因扩增及克隆载体构建
            3.3 DNA测序结果
            3.4 真核表达质粒鉴定
            3.5 最佳zeocin筛选浓度
            3.6 RT-PCR/Western-blot检测重组细胞株CYP3A29基因的表达
        4 讨论
            4.1 猪CYP3A29基因的克隆
            4.2 重组质粒转染PAM
            4.3 猪CYP3A29高表达细胞的筛选
            4.4 转染效果的验证
        小结
    第二章 CYP3A29基因在肺炎支原体感染过程中的作用
        1 实验材料
            1.1 主要仪器设备
            1.2 主要药品、试剂、耗材
            1.3 菌株和细胞
        2 试验方法
            2.1 肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞
            2.2 肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞效果的鉴定
                2.2.1 细胞总RNA的提取
                2.2.2 反转录
                2.2.3 猪肺炎支原体特异性鉴定基因P36的PCR扩增
            2.3 Real-time定量PCR
        3 数据分析
        4 实验结果
            4.1 肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞
            4.2 肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞效果的PCR鉴定
            4.3 攻毒后不同处理组细胞基因水平的检测
            4.4 各处理组PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8转录水平比较
        5 讨论
全文结论
参考文献
致谢
发表论文



本文编号：3321098