猪顺式作用元件UCOE的筛选与功能鉴定
发布时间：2021-08-05 16:15
源于人HNRPA2B1/CBX3基因座位的染色质开放元件UCOE包含一个双向启动子及无甲基化的CpG岛,具有染色质重塑功能。当它作为调控元件连接在启动子的上游时能够防止转录沉默,增强转基因的表达水平。为了研究猪UCOE在临床应用中所发挥的功能,本试验筛选了猪最佳UCOE片段。首先利用人UCOE序列进行同源比对得到猪UCOE序列。通过酶切以及RT-PCR方法得到14个不同大小位置的猪UCOE片段,将其分别与pDRIVE5-GFP-2载体连接,构建14个不同大小的载体,转染HEK293T细胞,使用GFP2-hUCOE作为对照,24h后收集细胞,通过RT-PCR及Western blot检测报告基因绿色荧光蛋白GFP的表达量,筛选出能使GFP基因稳定高效表达的最佳UCOE片段,并观察其绿色荧光持续时间。将筛选后的最佳UCOE片段插入重组质粒pCpG-Mini-GFP中进一步验证UCOE片段功能。结果显示,构建猪的14个重组质粒以及GFP2-hUCOE成功在HEK293T细胞进行了过表达。与对照组GFP2-hUCOE相比,p6号质粒GFP的相对表达量最高,且绿色荧光时间持续14天,表明p6号质...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１人ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３基因座位的结构??Ｆｉ．ｌ?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３ｅｎｅ?ｌｏｃｕｓ??
河南农业大学２０１４届硕士研究生学位论文??⑤加入等体积的酚？氯仿？异戊醇（２５：２４：１），轻轻颠倒混勻。４°Ｃ，?１２０００ｒｐｍ，离心ｌＯｍｉｎ，??出现分层。??⑥吸取上层至新的ＥＰ管中，加３／８倍体积的１０Ｍ乙酸铵、２倍体积的冷无水乙醇，颠倒混??匀，放置－８０°Ｃ，?３０ｍｉｎ。??⑦４°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，离心?ｌＯｍｉｎ，弃上清，留沉淀。加入?７５％乙醇?ｌｍＬ，?４°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，??离心５ｍｉｎ，弃上清，留沉淀。??⑧加入２〇ｎＬ?ｌｘＴＥ?ｂｕｆｆｅｒ溶解沉淀，６５°Ｃ孵育６ｈ以上。加入适量ＲＮａｓｅ，?３７°Ｃ孵育ｌｈ。??通过０．８％琼脂糖凝胶电泳检测基因组ＤＮＡ的提取质量。－２０°Ｃ保存备用。??３．２．?２．２引物设计与合成??根据同源比对出的猪ＵＣＯＥ（ｓＵＣＯＥ）序列以及其酶切位点所在位置（图２琍用Ｐｒｉｍｅｒ５．０??软件设计目的片段引物。设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表１）。??
使用全血基因ＤＮＡ提取试剂盒提取人基因组ＤＮＡ结果见图３。采用ＰＣＲ技术从人全血??基因组ＤＮＡ中扩增ｈＵＣＯＥ片段，ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，在１５５０ｂｐ左右有??一特异性条带（图４Ａ），与预计片段大小一致。ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１９－Ｔ载体连接，构建重组??质粒ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ，用Ｓｍａｌ对质粒进行单酶切，得到３５６２ｂｐ和７００ｂｐ两个条带，与预??期相符（图４Ｂ）。??图３人全血基因组ＤＮＡ的电泳图??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈｕｍａｎ?ｂｌｏｏｄ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??Ｍｌ?Ｍ２??丨．??ｉ二：；３?５６２ｂｐ??７００ｂｐ??１５５０ｂｐ？￣２??图４?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ质粒的构建??注：Ａ是ｈＵＣＯＥ的ＰＣＲ扩增图；Ｂ是ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ质粒经Ｓｍａｌ酶切鉴定图??Ｍｌ?：ＤＬ５０００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶ??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｎｏｔｅ：Ａ?ｉｓ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｈＵＣＯＥ；Ｂ?ｉｓ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣ０Ｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｂｙ?Ｓｍａｌ??Ｍｌ：ＤＬ５０００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶ??４．?１．２?ＧＦＰ２－ｈＵＣＯＥ质粒的构建??用Ｎｓｉ丨和Ｓｄａｌ分别对ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ和ｐＤＲ丨ＶＥ５－ＧＦＰ－２进行双酶切，分别得到??１５５８ｂｐ，２７０１ｂｐ与３５８９ｂｐ特异性条带（图５Ａ，图５Ｂ），与预期一致。目的片段连接，构建??ＧＦＰ２－ｈＵＣＯＥ质粒
【参考文献】：
期刊论文
[1]SAR与植物转基因沉默的消除[J]. 刘昕,傅荣昭,蔡民华,李文彬. 生物工程进展. 1998(04)
本文编号：3324064
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１人ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３基因座位的结构??Ｆｉ．ｌ?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３ｅｎｅ?ｌｏｃｕｓ??
河南农业大学２０１４届硕士研究生学位论文??⑤加入等体积的酚？氯仿？异戊醇（２５：２４：１），轻轻颠倒混勻。４°Ｃ，?１２０００ｒｐｍ，离心ｌＯｍｉｎ，??出现分层。??⑥吸取上层至新的ＥＰ管中，加３／８倍体积的１０Ｍ乙酸铵、２倍体积的冷无水乙醇，颠倒混??匀，放置－８０°Ｃ，?３０ｍｉｎ。??⑦４°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，离心?ｌＯｍｉｎ，弃上清，留沉淀。加入?７５％乙醇?ｌｍＬ，?４°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，??离心５ｍｉｎ，弃上清，留沉淀。??⑧加入２〇ｎＬ?ｌｘＴＥ?ｂｕｆｆｅｒ溶解沉淀，６５°Ｃ孵育６ｈ以上。加入适量ＲＮａｓｅ，?３７°Ｃ孵育ｌｈ。??通过０．８％琼脂糖凝胶电泳检测基因组ＤＮＡ的提取质量。－２０°Ｃ保存备用。??３．２．?２．２引物设计与合成??根据同源比对出的猪ＵＣＯＥ（ｓＵＣＯＥ）序列以及其酶切位点所在位置（图２琍用Ｐｒｉｍｅｒ５．０??软件设计目的片段引物。设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表１）。??
使用全血基因ＤＮＡ提取试剂盒提取人基因组ＤＮＡ结果见图３。采用ＰＣＲ技术从人全血??基因组ＤＮＡ中扩增ｈＵＣＯＥ片段，ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，在１５５０ｂｐ左右有??一特异性条带（图４Ａ），与预计片段大小一致。ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１９－Ｔ载体连接，构建重组??质粒ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ，用Ｓｍａｌ对质粒进行单酶切，得到３５６２ｂｐ和７００ｂｐ两个条带，与预??期相符（图４Ｂ）。??图３人全血基因组ＤＮＡ的电泳图??Ｆｉｇ．３?Ｔｈｅ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈｕｍａｎ?ｂｌｏｏｄ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??Ｍｌ?Ｍ２??丨．??ｉ二：；３?５６２ｂｐ??７００ｂｐ??１５５０ｂｐ？￣２??图４?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ质粒的构建??注：Ａ是ｈＵＣＯＥ的ＰＣＲ扩增图；Ｂ是ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ质粒经Ｓｍａｌ酶切鉴定图??Ｍｌ?：ＤＬ５０００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶ??Ｆｉｇ．４?Ｔｈｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ?ｐｌａｓｍｉｄ??Ｎｏｔｅ：Ａ?ｉｓ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｈＵＣＯＥ；Ｂ?ｉｓ?ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣ０Ｅ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｂｙ?Ｓｍａｌ??Ｍｌ：ＤＬ５０００；Ｍ２：ＭａｒｋｅｒＶ??４．?１．２?ＧＦＰ２－ｈＵＣＯＥ质粒的构建??用Ｎｓｉ丨和Ｓｄａｌ分别对ｐＭＤ１９－Ｔ－ｈＵＣＯＥ和ｐＤＲ丨ＶＥ５－ＧＦＰ－２进行双酶切，分别得到??１５５８ｂｐ，２７０１ｂｐ与３５８９ｂｐ特异性条带（图５Ａ，图５Ｂ），与预期一致。目的片段连接，构建??ＧＦＰ２－ｈＵＣＯＥ质粒
【参考文献】：
期刊论文
[1]SAR与植物转基因沉默的消除[J]. 刘昕,傅荣昭,蔡民华,李文彬. 生物工程进展. 1998(04)
本文编号：3324064
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