犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究

发布时间：2021-08-06 13:26

　　犬瘟热（Canine distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起食肉科动物死亡的急性、高度接触性传染病。近年来，随着全球环境变化、动物栖息地的人为频繁干预及病毒的进化，CDV的自然宿主已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩大到猫科、灵猫科等所有陆地食肉科动物，此外也有偶蹄目、海豹和非人灵长类自然感染CDV的报道。CDV给全球动物养殖业和生物多样性带来极大损失和危害的同时，其社会公共危害性越来越受到人们重视。传代细胞系上缺少CDV病毒受体，人工分离培养病毒十分困难，导致人们对病毒的病原学与免疫研究认知较其它病毒而言发展相对缓慢，特别是在免疫预防方面一直沿用上世纪50年代研制的CDV。因此，当前构建高效分离CDV的敏感细胞系，建立病毒的反向遗传操作平台，分离研究当前流行犬瘟热野毒株的特性，分析野毒株与商业疫苗毒株抗原蛋白分子特性及抗原蛋白差异，开展有效安全成本低廉犬用疫苗或佐剂的研制具有重大意义，对预防控制国内犬瘟热疫情蔓延具有重要现实意义。I表达犬瘟热病毒SLAM受体的敏感细胞系构建及其病毒的分离与鉴定鉴于传统的CDV分离培养方法有... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：137 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
目录
第一篇 绪论
    1.1 犬瘟热概述
        1.1.1 犬瘟热病毒
        1.1.2 病毒分离培养
        1.1.3 病毒蛋白
        1.1.4 致病机理和临床特征
        1.1.5 流行病学
        1.1.6 犬瘟热疫苗研究现状
        1.1.7 犬瘟热病毒感染性克隆研究现状
    1.2 犬瘟热病毒受体研究进展
        1.2.1 信号淋巴细胞激活分子
        1.2.2 Nectin-4
        1.2.3 其他受体
        1.2.4 总结
    1.3 白细胞介素 18 研究进展
        1.3.1 IL-18 的发现
        1.3.2 IL-18 分子结构
        1.3.3 IL-18 基因及基因调节
        1.3.4 IL-18 产生和递呈
        1.3.5 IL-18 的生物学功能
        1.3.6 IL-18 对宿主免疫保护作用
        1.3.7 展望
第二篇 研究内容
    第一章 表达犬瘟热病毒 SLAM 受体的敏感细胞系构建及病毒分离与鉴定
        1.1 材料方法
            1.1.1 病料、质粒和细胞
            1.1.2 主要试剂与仪器
            1.1.3 引物的设计与合成
            1.1.4 真核表达载体构建
            1.1.5 表达 SLAM 蛋白 Vero 细胞系的构建
            1.1.6 RT-PCR 方法鉴定 SLAM/Vero 细胞系
            1.1.7 间接免疫荧光方法鉴定
            1.1.8 流式细胞检测 SLAM/Vero 细胞系
            1.1.9 猴源和犬源 CDV 的分离与鉴定
            1.1.10 病毒在 SLAM／Vero 细胞生长特性研究
        1.2 结果
            1.2.1 真核表达载体的构建
            1.2.2 SLAM/Vero 细胞系的构建与鉴定
            1.2.3 利用 Vero/DogSLAM 细胞系分离犬瘟热病毒
            1.2.4 犬源 CDV 和猴源 CDV 对不同动物 SLAM 受体利用比较分析
        1.3 讨论
        1.4 小结
    第二章 现行不同疫苗株犬瘟热病毒免疫效果评价及其 H 蛋白基因特性分析研究
        2.1 材料与方法
            2.1.1 疫苗毒株、细胞和动物细胞、质粒与单克隆抗体
            2.1.2 主要试剂与仪器
            2.1.3 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评价
            2.1.4 引物的设计与合成
            2.1.5 RT-PCR 克隆 4 株疫苗株 CDV 的 H 基因
            2.1.6 CDV H 基因序列分析
            2.1.7 真核表达载体构建
            2.1.8 细胞转染
            2.1.9 间接免疫荧光检测
            2.1.10 犬瘟热病毒 H 蛋白三维构象建立
        2.2 结果
            2.2.1 不同疫苗株 CDV 在犬和狐狸体内免疫效果评估
            2.2.2 PCR 扩增结果
            2.2.3 不同毒株 H 基因核苷酸及其对应的氨基酸同源性比较
            2.2.4 H 基因系统发生进化树分析
            2.2.5 H 基因氨基酸序列分析结果
            2.2.6 犬瘟热病毒 H 蛋白糖基化位点分析
            2.2.7 野生株和疫苗株犬瘟热病毒 H 蛋白同源模型构建及比较
        2.3 讨论
        2.4 小结
    第三章 表达白细胞介素 18 的重组犬瘟热病毒感染性克隆构建与初步应用
        3.1 材料方法
            3.1.1 病毒株，质粒和细胞
            3.1.2 主要试剂与仪器
            3.1.3 引物的设计与合成
            3.1.4 感染性克隆载体的构建
            3.1.5 病毒的拯救
            3.1.6 RT-PCR 及测序鉴定
            3.1.7 Western blotting 鉴定
            3.1.8 重组病毒的培养与滴定
            3.1.9 重组病毒生长动力学研究
            3.1.10 IL-18 的生物活性评估
        3.2 结果
            3.2.1 表达犬 IL-18 基因的重组真核表达载体构建
            3.2.2 不同载体体系表达的 IL-18 活性评定
            3.2.3 粘附人 IL-2 信号肽的犬或鼠 IL-18 的重组犬瘟热病毒载体构建
            3.2.4 重组病毒的拯救及其鉴定
            3.2.5 Western blotting 鉴定重组病毒
            3.2.6 重组病毒生长动力学研究
            3.2.7 重组病毒分泌 IL-18 的生物活性能力检测
        3.3 讨论
        3.4 小结
结论
参考文献
导师简介
作者简介
攻读博士期间所得的科研成果
致谢



本文编号：3325859