布鲁菌BAB基因的原核表达及间接ELISA方法的建立
发布时间：2021-08-09 06:42
布鲁菌病是由布鲁菌引起的一种人畜共患病,以流产和发热为特征,严重威胁人类和许多动物的健康,同时也对畜牧业生产造成巨大损失。本研究以布鲁菌Rev.I株基因组为模板,扩增BAB基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,获得重组质粒pET-30a-BAB,并进行原核表达、Western-Blot检测及其抗体的间接ELISA方法建立。结果表明:本试验成功克隆并表达了 BAB基因,经SDS-PAGE分析纯化后的表达产物显示,本研究获得较纯蛋白;Western-Blot试验表明,该基因表达蛋白可与布鲁菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;随后,以BAB蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BAB抗体的间接ELISA方法。确定最佳包被条件为:BAB蛋白包被量0.25μg/mL,血清稀释度为1:400;封闭液为3%猪源明胶;二抗稀释度为1:6000;显色时间为10 min。通过对临床40份羊血清的检测,计算得出临界值为0.607。当待检血清OD450值大于等于0.607时,判定为阳性,反之则判定为阴性。建立的BAB间接ELISA方法与SAT及RBPT相比,总符合率达到77.5%。
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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【参考文献】：
期刊论文
[1]布鲁氏菌病的危害及流行情况概述[J]. 李小明,田波,杨儒爱,祁光宇. 兽医导刊. 2019(05)
[2]五种不同检测方法检测牛布鲁氏菌病结果比较[J]. 张洪军,王会敏,李秀慧,王佩琪,陈瑞兰,赵晓光,刘国臣,张雪松. 中国畜牧兽医文摘. 2018(06)
[3]羊布鲁氏菌病4种血清学检测方法的临床应用比较[J]. 蔺旭光,史量全,李佳怡,郭双,张荣荣,白皓丞,李天旭,刘锴. 中国微生态学杂志. 2018(04)
[4]布鲁菌病诊疗专家共识[J]. 张文宏,张跃新. 中华传染病杂志. 2017 (12)
[5]人类布鲁氏菌病的PCR诊断技术研究进展[J]. 赵越,王英,于慧,王占黎. 包头医学院学报. 2015(03)
[6]牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法的建立[J]. 范晴,谢芝勋,谢志勤,刘加波,庞耀珊,邓显文,谢丽基,罗思思. 动物医学进展. 2015(02)
[7]布鲁氏菌病患者临床特征分析[J]. 李钊,曹新娜,姜鲁宁,李晓哲,山凤莲. 中华医院感染学杂志. 2015(03)
[8]布鲁菌病患者外周血NK细胞和T淋巴细胞亚群的变化[J]. 贾宇臣,其其格,郭菊红,赵海珍,乌云,奥敦托娅. 中华实验和临床感染病杂志(电子版). 2014(05)
[9]布鲁氏菌病研究进展[J]. 施旭光,凌锋. 浙江预防医学. 2014(06)
[10]布鲁氏菌病病原学研究进展[J]. 孙涛,赵宝,冉红志,朱永周,许敏. 家畜生态学报. 2014(01)
博士论文
[1]流产布鲁菌BABRS22915与BABRS27735基因定向缺失株的构建及生物学特性的研究[D]. 鲍衍清.中国农业科学院 2017
硕士论文
[1]宿主Prdx6与生殖系统相关细胞内布鲁氏菌寄生关系的研究[D]. 翟菲菲.吉林大学 2019
[2]慢性布鲁氏菌病患者γδT及相关淋巴细胞的表达[D]. 任倩倩.天津医科大学 2019
[3]布鲁氏菌S2疫苗免疫绵羊血清抗体消长规律研究[D]. 刘宁.内蒙古农业大学 2016
[4]布鲁氏菌BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC基因的原核表达以及检测血清抗体的间接ELISA方法的建立[D]. 王勇.扬州大学 2013
[5]奶牛布鲁氏菌病病原分离及PCR快速检测方法的研究[D]. 乌伦吉如嘎.内蒙古农业大学 2006
本文编号：3331582
【文章来源】：内蒙古农业大学内蒙古自治区
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２原核表达载体的酶切鉴定??１＾１：１１？１＾１：双酶切？０１回收产物８八８?２：重组质粒??
?内蒙古农业大学硕士学位论文?１９＿??３结果??３．１目的基因扩增结果??羊种布鲁菌Ｒｅｖ．ｌ株ＢＡＢ基因的片段大小为１２４２?ｂｐ，ＰＣＲ扩增产物经１％琼??脂糖凝胶电泳分析，与预期大小相符（图１）。??Ｍ?１?２?３??２０００ｂｐ＾ｎ＾｜＾｜＾ｌ??７５０ｂｐ??５００ｂｐ??２５〇ｂｐ??图１?ＰＣＲ扩增或胶回收产物??Ｍ：ｍａｋｅｒ?１－３：?ＰＣＲ?扩增?ＢＡＢ??Ｆｉｇ?．１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｒ?ｇｅｌ?ｒｅｃｏｖｅｒｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ??３．２原核表达载体酶切鉴定结果??使用价？／／／和Ａ７？ｏ／核酸内切酶将重组质粒进行双酶切鉴定后与１％的琼脂糖凝??胶电泳进行检测，条带大小和预期结果相同（见图２）。??Ｍ?１?２??＼??３〇ｏ〇ｂｐ??２〇ｏ〇ｂＰＢ０ｓｅ??１５００ｂｐ＾＾ｆｌＨ??ｏｏｏｂｐ??７５０ｂｐ??５〇〇ｂｐ??２５０ｂｐ??ｌＯＯｂｏ?Ｉ??图２原核表达载体的酶切鉴定??１＾１：１１？１＾１：双酶切？０１回收产物８八８?２：重组质粒??Ｆｉｇ．２?Ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒｓ??
?内蒙古农业大学硕士学位论文??２１??３．４重组蛋白的纯化结果??收集洗脱液，取１０ｐＬ与等体积的２ｘｌ〇ａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ均匀混合，１００°Ｃ煮５ｍｉｎ，??电泳检测结果如图５所示。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，得到较纯蛋白。??Ｍ?１??９４ｋＤ?…??６６．２ｋＤ?ｆ??４５ｋＤ??３３ｋＤ?—??２６ｋＤ?？??２０ｋＤ??图５目的蛋白纯化后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳图??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?１：纯化蛋白稀释?５?倍?１２％?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??Ｆｉｇ?．５?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｔａｒｇｅｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ??３．５重组蛋白Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ检测结果??对诱导３?ｈ后的重组蛋白纯化后进行Ｗｅｓｔｅｍ－Ｂｌｏｔ检测，１４?Ｖ电压下转膜６０??ｍｉｎ，孵育经本实验室鉴定的羊布鲁氏菌阳性血清，可见明显的目的条带，说明诱??导得到的重组蛋白能被ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ抗体识别，且大小与ｐＥＴ－３０ａ分子??质量加上目标分子蛋白质量的重组蛋白总分子质量相符（见图６）。??
【参考文献】：
期刊论文
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[4]布鲁菌病诊疗专家共识[J]. 张文宏,张跃新. 中华传染病杂志. 2017 (12)
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[7]布鲁氏菌病患者临床特征分析[J]. 李钊,曹新娜,姜鲁宁,李晓哲,山凤莲. 中华医院感染学杂志. 2015(03)
[8]布鲁菌病患者外周血NK细胞和T淋巴细胞亚群的变化[J]. 贾宇臣,其其格,郭菊红,赵海珍,乌云,奥敦托娅. 中华实验和临床感染病杂志(电子版). 2014(05)
[9]布鲁氏菌病研究进展[J]. 施旭光,凌锋. 浙江预防医学. 2014(06)
[10]布鲁氏菌病病原学研究进展[J]. 孙涛,赵宝,冉红志,朱永周,许敏. 家畜生态学报. 2014(01)
博士论文
[1]流产布鲁菌BABRS22915与BABRS27735基因定向缺失株的构建及生物学特性的研究[D]. 鲍衍清.中国农业科学院 2017
硕士论文
[1]宿主Prdx6与生殖系统相关细胞内布鲁氏菌寄生关系的研究[D]. 翟菲菲.吉林大学 2019
[2]慢性布鲁氏菌病患者γδT及相关淋巴细胞的表达[D]. 任倩倩.天津医科大学 2019
[3]布鲁氏菌S2疫苗免疫绵羊血清抗体消长规律研究[D]. 刘宁.内蒙古农业大学 2016
[4]布鲁氏菌BP26、OMP16、CP39、SP41和eryC基因的原核表达以及检测血清抗体的间接ELISA方法的建立[D]. 王勇.扬州大学 2013
[5]奶牛布鲁氏菌病病原分离及PCR快速检测方法的研究[D]. 乌伦吉如嘎.内蒙古农业大学 2006
本文编号：3331582
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