用于猪干细胞示踪的Oct4-eGFP报告系统建立
发布时间：2021-08-09 16:34
多能性干细胞既可以自我更新又可以分化成许多其他细胞类型，为发育生物学、细胞治疗及基因修饰的研究提供了基础，然而，猪的胚胎干细胞（ES）还未能建立，诱导多能性干细胞（iPS）研究中仍存在许多问题亟待解决。利用细胞多能性标记基因建立报告系统，可以为上述研究提供有价值的工具。Oct4基因是一种重要的细胞多能性标记，被广泛应用于小鼠及其它物种的多能性细胞的鉴定，可以用于干细胞示踪报告系统的建立。Oct4-eGFP是一种有效的细胞多能性可视化报告系统，转基因猪可作为细胞多能性研究的一种有重大价值的大动物模型，有助于猪ES和iPS细胞的建立。本研究利用TALENs（Transcription activator-like effector nuclease）介导的同源重组，将eGFP（enhanced green fluorescent protein）定点敲入内源性Oct4第5外显子的终止密码子处，利用内源性Oct4启动子驱动eGFP cDNA，从而更精确的示踪内源性Oct4的表达情况。成功建立了五指山小型猪Oct4-eGFP细胞系，通过体细胞核移植获得了Oct4-eGFP克隆胚胎。结果如下：研...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
同源重组机制示意图
学院硕士学位论文 第一章中的地位。基因打靶技术的优势在与它能够实现外源基因的定点整和，使某一位修复或对细胞或动物基因组内某一确定的基因或 DNA 序列进行人工定点突因的功能。现代基因打靶技术的发展已使得对基因打靶进行时间和空间上的控细胞基因打靶效率低，因此需要采用一定的方法对阳性细胞进行富集（Sedi过基因打靶在基因靶位点引入筛选标记如新霉素抗性基因等，可以通过药物筛Charron et al, 1990; Schwartzberg et al, 1990）。正负筛选策略是 1988 年美国 U人建立的，不受靶基因功能和表达情况的影响（图 1-2）。打靶载体中包含正筛选标记 TK，前者位于同源序列内，后者位于载体末端的同源序列外。在发生同记被引入靶位点，而 TK 不能整合入受体细胞基因靶位。随机整合是 neo 和 TK中。neo 使发生同源重组的细胞具有对新霉素的抗性，TK 基因的表达产物可以有细胞毒性的核苷酸。用含有新霉素和丙氧鸟苷的培养基进行培养，可以排除整合的细胞株，从而提高同源重组的效率（Mansour et al, 1988）。
图 1-3 TALENs 引起 DSB 的修复方式Fig1-3 The repair method of DSB caused by TALENs策略具有自我剪切功能的多肽序列，来源于小核糖核酸病毒家族，例炎病毒（ERAV），以及其他病毒例如猪肠病毒-1 等。2A 肽由 20列为 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro，可以在最后两位氨基酸种断裂在细胞中是自发的，且不需要酶的参与（Donnelly et al, 2前认为是在 mRNA 翻译的过程中，2A 肽的最后两位氨基酸残基, 2012)，故由 2A 肽相连的两个基因表达后可以形成两个独立的蛋段约 20 个氨基酸残基的短肽，后一个蛋白的 N 端增加一个脯氨个基因的编码区串联，可以实现在一个启动子调控下的多基因共糖体进入位点（Internal ribosome entry site, IRES）策略会导致后不会有这种影响。目前，已经有许多研究利用来源于不同病毒的
【参考文献】：
期刊论文
[1]人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J]. 肖安,胡莹莹,王唯晔,杨志芃,王展翔,黄鹏,佟向军,张博,林硕. 遗传. 2011(07)
[2]模式动物与人类疾病的动物模型[J]. 江虎军,冯锋,董尔丹. 生命科学. 2011(03)
[3]Oct4基因的研究进展[J]. 郑鹏生,曹浩哲. 西安交通大学学报(医学版). 2010(05)
[4]含FMDV 2A序列PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒的构建与鉴定[J]. 云涛,倪征,余斌,陈柳,华炯钢,王根荣,张彦明,刘光清. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2009(08)
[5]胚胎干细胞的鉴定方法(英文)[J]. 王正朝,许卫华,庞训胜,石放雄,王锋. 中国临床康复. 2006(05)
[6]Oct4调节胚胎干细胞全能性扩增的研究进展[J]. 刘善荣. 第二军医大学学报. 2003(09)
本文编号：3332416
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
同源重组机制示意图
学院硕士学位论文 第一章中的地位。基因打靶技术的优势在与它能够实现外源基因的定点整和，使某一位修复或对细胞或动物基因组内某一确定的基因或 DNA 序列进行人工定点突因的功能。现代基因打靶技术的发展已使得对基因打靶进行时间和空间上的控细胞基因打靶效率低，因此需要采用一定的方法对阳性细胞进行富集（Sedi过基因打靶在基因靶位点引入筛选标记如新霉素抗性基因等，可以通过药物筛Charron et al, 1990; Schwartzberg et al, 1990）。正负筛选策略是 1988 年美国 U人建立的，不受靶基因功能和表达情况的影响（图 1-2）。打靶载体中包含正筛选标记 TK，前者位于同源序列内，后者位于载体末端的同源序列外。在发生同记被引入靶位点，而 TK 不能整合入受体细胞基因靶位。随机整合是 neo 和 TK中。neo 使发生同源重组的细胞具有对新霉素的抗性，TK 基因的表达产物可以有细胞毒性的核苷酸。用含有新霉素和丙氧鸟苷的培养基进行培养，可以排除整合的细胞株，从而提高同源重组的效率（Mansour et al, 1988）。
图 1-3 TALENs 引起 DSB 的修复方式Fig1-3 The repair method of DSB caused by TALENs策略具有自我剪切功能的多肽序列，来源于小核糖核酸病毒家族，例炎病毒（ERAV），以及其他病毒例如猪肠病毒-1 等。2A 肽由 20列为 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro，可以在最后两位氨基酸种断裂在细胞中是自发的，且不需要酶的参与（Donnelly et al, 2前认为是在 mRNA 翻译的过程中，2A 肽的最后两位氨基酸残基, 2012)，故由 2A 肽相连的两个基因表达后可以形成两个独立的蛋段约 20 个氨基酸残基的短肽，后一个蛋白的 N 端增加一个脯氨个基因的编码区串联，可以实现在一个启动子调控下的多基因共糖体进入位点（Internal ribosome entry site, IRES）策略会导致后不会有这种影响。目前，已经有许多研究利用来源于不同病毒的
【参考文献】：
期刊论文
[1]人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J]. 肖安,胡莹莹,王唯晔,杨志芃,王展翔,黄鹏,佟向军,张博,林硕. 遗传. 2011(07)
[2]模式动物与人类疾病的动物模型[J]. 江虎军,冯锋,董尔丹. 生命科学. 2011(03)
[3]Oct4基因的研究进展[J]. 郑鹏生,曹浩哲. 西安交通大学学报(医学版). 2010(05)
[4]含FMDV 2A序列PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒的构建与鉴定[J]. 云涛,倪征,余斌,陈柳,华炯钢,王根荣,张彦明,刘光清. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2009(08)
[5]胚胎干细胞的鉴定方法(英文)[J]. 王正朝,许卫华,庞训胜,石放雄,王锋. 中国临床康复. 2006(05)
[6]Oct4调节胚胎干细胞全能性扩增的研究进展[J]. 刘善荣. 第二军医大学学报. 2003(09)
本文编号：3332416
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