比格犬ERβ剪切异构体蛋白定位及其RNAi慢病毒载体的构建及筛选

发布时间：2021-08-10 18:58

　　比格犬广泛应用于国家二类以上新药研发，但比格犬在繁殖方面出现了不发情、发情不孕、休情期长、窝产仔数减少等现象，为了探讨该犬繁殖性能降低的机理，本研究对ERβ剪切异构体的蛋白定位及其生物学功能进行研究。通过构建ERβ剪切异构体重组真核表达载体，瞬时转染HEK293T细胞，检测目的蛋白在体外细胞表达及定位情况；建立稳定表达ERβ剪切异构体细胞系；构建针对目的基因慢病毒介导RNA干涉表达载体，利用荧光定量PCR方法和Western Blot方法在mRNA水平和蛋白水平上检测对目的基因干涉效果。结果表明：成功构建比格犬ERβ剪切异构体MYC标签重组真核表达载体，WB结果显示，ERβ1293编码430aa，蛋白量大小为48kDa；ERβ1257编码419aa，蛋白量大小为47kDa；体外细胞蛋白定位结果表明，ERβ1293主要定位于细胞质，而ERβ1257均主要定位于细胞核；成功构建稳定表达ERβ1293和ERβ1257细胞株，WB结果表明目的基因得到高效的表达；分别针对两条ERβ剪切异构mRNA，各构建三条shRNA序列及一条shNC，并合成于慢病毒载体。qRT-PCR方法从mRNA水平检测干... 

【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省

【文章页数】：83 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

ERs结构示意图

二章 比格犬 ERβ 剪切异构体体外细胞蛋白定位1290、pEGFP-N1-ERβ1254 重组真核表达载酶，成功克隆 ERβ1293、ERβ1257（均含糖凝胶电泳 DNAMarker 2 000 位置比对，克隆阳性菌液经测序比对，均与比格犬 ER突变，可用于后续的重组表达载体的构建电泳图。M1 2

Rβ1257 重组质粒的测序两条 ERβ 基因剪切异构体 ERβ1293 和 ERβ12基或氨基酸突变，可用于真核表达实验。t 鉴定 ERβ1293、ERβ1257 MYC 标签重组质粒显示：检测到目的蛋白在 HEK293T 细胞中瞬列 3 和 4）MYC 标签融合蛋白分子量分别为 49kDa，证明 ERβ1293 和 ERβ1257 MYC 标签重签白1 2 3 4 5 6 7 8 2.4 重组质粒 XhoI 和 BamHI 双酶切鉴定结果3：pcDNA3.1-MYC-ERβ1293；4~6：pcDNA3 Results of Recombinant Plasmids to Check with~3：pcDNA3.1-MYC-ERβ1293；4~6：pcDNA

【参考文献】：
期刊论文
[1]雌激素受体信号通路在乳腺癌发生和治疗中的作用[J]. 谭小宁,周知,谢小雷,罗志勇.  生命科学. 2011(10)
[2]一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析[J]. 孔德强,李爱学,曾林,赵彦斌,孙兆增,胡仲明.  中国比较医学杂志. 2011(07)
[3]雌激素受体β1上调p53基因表达促进乳腺癌细胞的凋亡[J]. 陈莉,杨新华,杨程,张玲玲,任林,姜军.  中国普外基础与临床杂志. 2010(02)
[4]重组质粒PcDNA3.1-P30-P22-CTXA2/B在Hela细胞中表达的研究[J]. 江渊,古钦民.  热带病与寄生虫学. 2004(04)
[5]G418抗性HEK293细胞的培育[J]. 吕茂民,贾莉玮,王建国,杨姝,熊景峰,章金刚.  中国实验动物学报. 2003(01)



本文编号：3334606