卵泡抑素对牛颗粒细胞调控机制的研究

发布时间：2021-08-11 02:58

　　通常认为,卵泡抑素（Follistatin, FST）作为一种活化素结合蛋白,参与调节哺乳动物卵泡发育,但其是否能通过自分泌作用直接调节颗粒细胞和卵泡的发育,尚无文献报道。为了研究卵泡抑素对黄牛颗粒细胞的调控作用,本研究构建卵泡抑素RNA干扰载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen,在mRNA和蛋白水平干扰牛颗粒细胞中卵泡抑素的表达,发现在干扰卵泡抑素表达后：（1）流式细胞仪检测黄牛颗粒细胞的周期发现,更多的细胞阻滞在G1期,控制细胞周期的p21基因蛋白表达量显著上调；（2）流式细胞仪检测颗粒细胞的凋亡发现,细胞早期和晚期凋亡都显著增加,通过RT-PCR和Western Blot分析凋亡相关基因的表达发现,Caspase-3和BAX的表达水平显著上调,而Bcl-2的表达水平则显著下调；（3）ELISA检测颗粒细胞分泌活化素、雌激素和孕激素浓度发现,活化素分泌显著上调,雌激素分泌量显著下降,而孕激素变化不显著；（4）通过RT-PCR检测转染后颗粒细胞中活化素受体及抑制素各亚基的mRNA水平,发现所有活化素受体（ACVR1.ACVR2A和ACVR2B）以及抑制素... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 文献综述
    1.1 卵泡抑素的研究进展
        1.1.1 卵泡抑素基本结构
        1.1.2 卵泡抑素的生理作用
    1.2 卵泡抑素在颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁中可能的机制
        1.2.1 活化素诱导颗粒细胞的凋亡
        1.2.2 卵泡抑素与活化素相互作用机制
    1.3 卵泡抑素的主要研究手段进展
        1.3.1 卵泡抑素主要研究方法
        1.3.2 RNA干扰技术研究卵泡抑素
    1.4 本试验目的及意义
2 材料
    2.1 试验细胞
    2.2 干扰载体
    2.3 主要试剂及耗材
    2.4 主要试剂盒
    2.5 主要抗体
    2.7 主要实验仪器
    2.8 试剂的配置
3 方法
    3.1 黄牛颗粒细胞的分离与培养
    3.2 黄牛颗粒细胞表达FST的验证
        3.2.1 颗粒细胞总RNA的提取及cDNA第一链合成
        3.2.2 PCR扩增FST基因
    3.3 FST基因RNA干扰载体构建
        3.3.1 设计与合成shRNA序列
        3.3.2 退火
        3.3.3 重组质粒的构建
        3.3.4 RNA干扰质粒的克隆与纯化提取
    3.4 FST干扰质粒转染黄牛颗粒细胞
        3.4.1 细胞的准备
        3.4.2 确定最优脂质体添加量
        3.4.3 FST干扰质粒转染黄牛颗粒细胞
    3.5 转染后FST及相关基因的相对表达量分析
        3.5.1 转染后颗粒细胞表达卵泡抑素的干扰效率检测
        3.5.2 检测卵泡抑素相关基因检测
    3.6 流式检测转染后细胞凋亡
    3.7 流式检测转染后细胞周期
    3.8 ELISA检测活化素、雌激素和孕激素浓度
    3.9 转染后卵泡抑素及凋亡和周期相关蛋白检测
        3.9.1 颗粒细胞总蛋白的提取
        3.9.2 颗粒细胞总蛋白含量的测定
        3.9.3 SDS-PAGE电泳及蛋白成像
4 结果与分析
    4.1 验证颗粒细胞表达FST
    4.2 FST干扰质粒鉴定、转染及干扰效果
        4.2.1 FST干扰质粒测序结果
        4.2.2 最优脂质体添加量
        4.2.3 FST干扰质粒转染效率
        4.2.4 两种FST干扰质粒对卵泡抑素干扰效果
    4.3 转染FST干扰质粒对黄牛颗粒细胞的影响
        4.3.1 转染对细胞周期的影响
        4.3.2 转染对凋亡的影响
        4.3.3 转染对颗粒细胞类固醇激素分泌量的影响
        4.3.4 转染对颗粒细胞抑制素各亚基及活化素受体的影响
5 讨论
6 小结
参考文献
致谢



本文编号：3335305