PEDV感染对Vero细胞周期的影响及其机制研究
发布时间：2021-08-12 09:30
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒科的α冠状病毒亚科猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种强感染致病性的传染病,该病能够引起各年龄段猪水样腹泻、呕吐和仔猪高死亡率,自2010年PED在我国大范围流行,给养猪业造成重大损失。本课题研究PEDV感染对细胞周期的影响及其相关机制,分析PEDV对Vero细胞周期的调控机制及周期阻滞对PEDV的增殖和致病性的影响,从而为揭示PEDV的分子致病机制及PED防控提供了理论支撑。本研究首先对PEDV与Vero细胞的相互作用进行研究,通过MTT法检测PEDV复制对Vero细胞活力的影响,确定本次研究PEDV感染剂量0.5 MOI,Vero细胞收集时间段为0、6、12、18、24h。用本试验室分离保存的0.5 MOI PEDV分别感染异步化和同步化的Vero细胞,胰酶消化收集感染不同时间段细胞,利用PI-BrdU双染法处理细胞,使用流式细胞术检测PEDV对Vero细胞周期的影响,结果显示PEDV引起Vero细胞周期阻滞在G0/G1期。为了进一...
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV病毒粒子模型图
等从 50 份阳性病料中分离到 2 株 PEDV 病毒(ISU13-22038 和 ISU13-19338E)[34]；2014年，Tomoichiro等从88份PEDV阳性病料中成功分离到9株可以稳定传代的PEDV[35]；2014 年 9 月，韩国学者从 57 份阳性病料中分离到 1 株 KNU-141112 PEDV[36]，这种情况的出现在很大程度上限制着 PEDV 分子生物学研究的成长，亟待解决 PEDV 体外培养对细胞的适应性。1.5 PEDV 基因组结构及其编码蛋白的功能PEDV 是双囊膜、单股线性，全长约 28033nt 的正链 RNA。PEDV 具有冠状病毒共有的基因组结构，如图 1-2 所示从 5’端-3’端 PEDV 的基因组结构依次为：5’端是由帽子结构(cap)、前导序列(L)和 Kozak 序列(GUUCaugC)组成的长度约为 296nt；大小约20346nt的编码复制酶多聚非结构蛋白占5’端2/3基因组的(12354ntORFla和8037ntORF1b)；占 3’端 1/3 的基因组包括 150-220kDa 纤突蛋白(S)、ORF3、7kDa 小膜蛋白(E)、20-30kDa 膜糖蛋白(M)和 58kDa 核衣壳蛋白(N)；3’端是由 8 个碱基(GGAAGAGC)构成的保守序列和 1 个 Poh(A)尾构成的大小约为 334nt。PEDV 基因组从头到尾结构次序为：5’-Rep-S-ORF3-E-M-N-3’，且相邻基因之间有基因间隔序列(IS)，对 PEDV 的复制和翻译其重要作用[37-39]。
图 1-3 真核细胞周期概述[60]Fig 1-3 Overview of the eukaryotic cell cycle2.1 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs)CDKs 是参与细胞周期调控的主要蛋白，根据蛋白的组成和功能可以将其归纳在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族里面。截止现在已被挖掘并命名的 CDKs 家族具有 13 个成员组织：CDK1-CDK13，其中参与细胞周期进程的 CDKs 主要包含 5 个，分别为：推动细胞由 G0 期进入 G1 期的 CDK2、CDK4 和 CDK6；推动细胞由 G1 期晚期进入到 S 期的 CDK2；在 G2/M 期中具有高度酶活性的 CDK1(CDK2)；通过与细胞周期蛋白 H 偶联而具备拥有激酶活性的 CDK7[60]。CDKs 产生的升高或降低受到 Cyclins 的调节。当 CDKs 与 Cyclin 结合形成结合物进一步刺激 CDKs 的活性进而调整细胞的基因组复制和有丝分裂促进细胞周期的转换。CDK1 又被叫做 CDC2 或者 CDK28A，具有高度的保守性，可以与 Cyclin A 或 B结合来促进细胞周期 S/G2 或 G2/M 的转换同时也表现丝氨酸/苏氨酸激酶的作用，在调控细胞周期进程中占重要地位。有研究表明，在敲除小鼠 CDK1 基因后，其细胞周
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒的特性研究[J]. 王靓靓,张艳,白会新. 猪业科学. 2016(06)
[2]2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV-S基因型分析[J]. 杜晓莉,王一成,吴润,徐丽华,袁秀芳,李军星,周晓丽. 浙江农业学报. 2014(03)
[3]猪流行性腹泻病毒贵州株的分离及M基因序列分析[J]. 王伟丞,曾智勇,梁海英,刘钊. 贵州农业科学. 2014(06)
[4]猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性[J]. 毛雅元,张桂红,葛俊伟,姜艳平,乔薪瑗,崔文,李一经. 病毒学报. 2010(06)
[5]猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,刘胜旺,陈洪岩,佟有恩,李伟杰,王明,马思奇,陈建飞. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[6]青海地区猪流行性腹泻病调查[J]. 程庆华,牛小迎,叶成玉. 青海畜牧兽医杂志. 1992(03)
[7]应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 宣华,邢德坤,王殿瀛,朱维正,赵凤玉,巩怀俊,费思阁. 兽医大学学报. 1984(03)
本文编号：3338062
【文章来源】：安徽农业大学安徽省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV病毒粒子模型图
等从 50 份阳性病料中分离到 2 株 PEDV 病毒(ISU13-22038 和 ISU13-19338E)[34]；2014年，Tomoichiro等从88份PEDV阳性病料中成功分离到9株可以稳定传代的PEDV[35]；2014 年 9 月，韩国学者从 57 份阳性病料中分离到 1 株 KNU-141112 PEDV[36]，这种情况的出现在很大程度上限制着 PEDV 分子生物学研究的成长，亟待解决 PEDV 体外培养对细胞的适应性。1.5 PEDV 基因组结构及其编码蛋白的功能PEDV 是双囊膜、单股线性，全长约 28033nt 的正链 RNA。PEDV 具有冠状病毒共有的基因组结构，如图 1-2 所示从 5’端-3’端 PEDV 的基因组结构依次为：5’端是由帽子结构(cap)、前导序列(L)和 Kozak 序列(GUUCaugC)组成的长度约为 296nt；大小约20346nt的编码复制酶多聚非结构蛋白占5’端2/3基因组的(12354ntORFla和8037ntORF1b)；占 3’端 1/3 的基因组包括 150-220kDa 纤突蛋白(S)、ORF3、7kDa 小膜蛋白(E)、20-30kDa 膜糖蛋白(M)和 58kDa 核衣壳蛋白(N)；3’端是由 8 个碱基(GGAAGAGC)构成的保守序列和 1 个 Poh(A)尾构成的大小约为 334nt。PEDV 基因组从头到尾结构次序为：5’-Rep-S-ORF3-E-M-N-3’，且相邻基因之间有基因间隔序列(IS)，对 PEDV 的复制和翻译其重要作用[37-39]。
图 1-3 真核细胞周期概述[60]Fig 1-3 Overview of the eukaryotic cell cycle2.1 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDKs)CDKs 是参与细胞周期调控的主要蛋白，根据蛋白的组成和功能可以将其归纳在丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族里面。截止现在已被挖掘并命名的 CDKs 家族具有 13 个成员组织：CDK1-CDK13，其中参与细胞周期进程的 CDKs 主要包含 5 个，分别为：推动细胞由 G0 期进入 G1 期的 CDK2、CDK4 和 CDK6；推动细胞由 G1 期晚期进入到 S 期的 CDK2；在 G2/M 期中具有高度酶活性的 CDK1(CDK2)；通过与细胞周期蛋白 H 偶联而具备拥有激酶活性的 CDK7[60]。CDKs 产生的升高或降低受到 Cyclins 的调节。当 CDKs 与 Cyclin 结合形成结合物进一步刺激 CDKs 的活性进而调整细胞的基因组复制和有丝分裂促进细胞周期的转换。CDK1 又被叫做 CDC2 或者 CDK28A，具有高度的保守性，可以与 Cyclin A 或 B结合来促进细胞周期 S/G2 或 G2/M 的转换同时也表现丝氨酸/苏氨酸激酶的作用，在调控细胞周期进程中占重要地位。有研究表明，在敲除小鼠 CDK1 基因后，其细胞周
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒的特性研究[J]. 王靓靓,张艳,白会新. 猪业科学. 2016(06)
[2]2010—2013年浙江省猪流行性腹泻病毒临床检测及PEDV-S基因型分析[J]. 杜晓莉,王一成,吴润,徐丽华,袁秀芳,李军星,周晓丽. 浙江农业学报. 2014(03)
[3]猪流行性腹泻病毒贵州株的分离及M基因序列分析[J]. 王伟丞,曾智勇,梁海英,刘钊. 贵州农业科学. 2014(06)
[4]猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性[J]. 毛雅元,张桂红,葛俊伟,姜艳平,乔薪瑗,崔文,李一经. 病毒学报. 2010(06)
[5]猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白抗原间接ELISA抗体检测方法的建立[J]. 孙东波,冯力,时洪艳,刘胜旺,陈洪岩,佟有恩,李伟杰,王明,马思奇,陈建飞. 中国预防兽医学报. 2006(05)
[6]青海地区猪流行性腹泻病调查[J]. 程庆华,牛小迎,叶成玉. 青海畜牧兽医杂志. 1992(03)
[7]应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻病毒的研究[J]. 宣华,邢德坤,王殿瀛,朱维正,赵凤玉,巩怀俊,费思阁. 兽医大学学报. 1984(03)
本文编号：3338062
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