日本血吸虫精氨酸酶克隆表达及功能分析
发布时间：2021-08-12 10:34
日本血吸虫病是由日本血吸虫（Schistosome japonicum）感染所引起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病，筛选新的药物靶标，研制开发高效安全的血吸虫疫预防疫苗是血吸虫病防治研究的重要需求。精氨酸酶作为代谢酶，能够水解精氨酸产生鸟氨酸和尿素，在细胞增殖、胶原沉积和能量代谢过程中发挥着重要的作用，也可通过与一氧化氮合成酶（NOS）竞争消耗性底物精氨酸来调节NO的生成，影响机体的免疫应答。本课题组在前期日本血吸虫体被表膜蛋白研究中鉴定到精氨酸酶，为进一步阐明日本血吸虫精氨酸酶（SjARG）的特性和生物学功能，本文根据血吸虫精氨酸酶的参考序列，设计引物应用PCR克隆了SjARG基因，长度为1095bp，编码364个氨基酸，比对分析显示与曼氏血吸虫精氨酸酶（SmARG）相似性为79.7%。3D建模发现该蛋白结构中心含有两个Mn2+结合位点，与SmARG活性位点相似。构建了重组表达质粒pET-28a-SjARG，在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并纯化到可溶性重组蛋白rSjARG，分子量约为43kDa。Western-blotting分析显示重组蛋白具有良好的抗原性。实时定量PCR分...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
血吸虫生活史Figure1.1ThelifecycleofSchistosomajaponicum
感染危险的环境中 (Bergquist 2002; Engels et al., 2002)。在我国南方地区流行的吸虫（中国大陆株），人和动物感染后主要呈现急性或者慢性肠炎、肝硬化、等症状。日本血吸虫病主要流行分布于中国长江以南十三个省、市、自治区，此病的威胁（图 1.2）。解放前该病曾经严重影响了该地区的社会经济发展，给畜牧业发展构成了很大威胁。解放后政府投入巨大财力物力防治血吸虫病，随作力度的加强，血吸虫病在我国南方的流行态势得到了控制，取得了巨大的成生环境复杂、难以改变，人畜重复感染严重且保藏宿主种类多、数量大、活动主的传染源难以控制等原因，使得该病依然流行，2011 年我国仍有血吸虫病人血吸虫病的防治策略是控制传染源为主，治疗病人和病畜是其中重要的措施。面，吡喹酮是目前唯一大规模应用的药物，具有抗虫谱广、疗效高、毒性低、等优点(Gonnert & Andrews,1977; McMahon & Kolstrup,1979)。虽然吡喹酮治疗较好(Doenhoff et al.,2008)，但该药对预防血吸虫再感染的效果较差，而且从开有 30 年的历史 (Balen et al.,2007; Fenwick & Webster,2006)。寄生虫学者担心这可能使血吸虫在药物选择压力下产生耐药性。因此，发展血吸虫疫苗是综合防具有前瞻性的工作。化学药物治疗和疫苗预防相结合的方法是防控血吸虫病的向。
酸和一氧化氮。NOS 分为三种类型，包括诱导性一氧化氮合酶（inducible NOS）、神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS）和 内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS）。其中，iNOS 并不能持续表达，它能够在磷酸脂多糖（LPS）、磷脂酸（LTA）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、IL-1 和 IL-2。其中，它所产生的 NO 在机体内参与多种生理反应。一氧化氮在先天性免疫反应中具有重要作用能够清除利曼氏原虫，沙门氏菌和大肠杆菌等微生物 (Chakravortty et al., 2003)。研究表明胞内和胞外精氨酸的浓度是 NO 合成过程中一种重要的限速因子 (Wu et al., 1998)，精氨酸酶可通过与NOS 竞争消耗性底物精氨酸来调节 NO 的生成物（图 1.3）。精氨酸酶的 Km 值在 mM 的范围内而一氧化氮合酶的在 μM 范围内，这表明精氨酸酶的最大初速度是一氧化氮合酶的 1000 倍。cAMP、LPS、Th2 型的细胞因子譬如 IL-4 和 IL-13、TGF-β ，他们能够诱导巨噬细胞内精氨酸酶1 型的表达。而 Th1 型细胞因子譬如 IFN-γ 通过诱导巨噬细胞表达 NOS2 产生 NO，并且能够抑制 IL-4 和 IL-10 驱动的精氨酸酶 1 的表达。IL-4 和 IL-13 这些 Th2 型的细胞因子选择性活化能够抑制 NOS2 的功能，诱导巨噬细胞表达精氨酸酶 1 型，提高体液免疫，组织修复以及抗寄生虫的反应。此外，精氨酸酶产生的多按类物质能偶抑制那些会导致炎症的因子的产生。精氨酸酶被激活产生的脯氨酸，能够使胶原沉积，因此能够在炎症的地方进行组织修复（Shearer et al., 1997）。因此，精氨酸酶和一氧化氮合酶竞争性的关系，对 NO 产生的量影响巨大，这也决定也入侵的病原体的存亡。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sj26和Sj23基因转染树突状细胞联合抗血吸虫感染的研究[J]. 沈定文,罗金萍,李雍龙,刘文琪. 中国人兽共患病学报. 2008(10)
[2]日本血吸虫精氨酸酶新基因的鉴定及作为疫苗的保护性研究[J]. 李孜,余新炳,吴忠道,胡旭初. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2006(02)
[3]噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用[J]. 王欣之,傅志强. 中国兽医寄生虫病. 2005(01)
[4]噬菌体表达短肽模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的研究[J]. 周东明,曾宪芳,王敏,Larry McReynold,易新元. 中国人兽共患病杂志. 2002(01)
[5]血吸虫疫苗研究面临的问题[J]. 李焱. 国外医学(寄生虫病分册). 1999(03)
[6]紫外线减毒尾蚴疫苗预防BALB/C小鼠日本血吸虫病的研究[J]. 沈际佳,蒋作君,汪学龙,江宝玲. 中国公共卫生. 1998(01)
[7]日本血吸虫精氨酸酶的研究[J]. 陶义训,黄左钺. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 1964(02)
本文编号：3338159
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
血吸虫生活史Figure1.1ThelifecycleofSchistosomajaponicum
感染危险的环境中 (Bergquist 2002; Engels et al., 2002)。在我国南方地区流行的吸虫（中国大陆株），人和动物感染后主要呈现急性或者慢性肠炎、肝硬化、等症状。日本血吸虫病主要流行分布于中国长江以南十三个省、市、自治区，此病的威胁（图 1.2）。解放前该病曾经严重影响了该地区的社会经济发展，给畜牧业发展构成了很大威胁。解放后政府投入巨大财力物力防治血吸虫病，随作力度的加强，血吸虫病在我国南方的流行态势得到了控制，取得了巨大的成生环境复杂、难以改变，人畜重复感染严重且保藏宿主种类多、数量大、活动主的传染源难以控制等原因，使得该病依然流行，2011 年我国仍有血吸虫病人血吸虫病的防治策略是控制传染源为主，治疗病人和病畜是其中重要的措施。面，吡喹酮是目前唯一大规模应用的药物，具有抗虫谱广、疗效高、毒性低、等优点(Gonnert & Andrews,1977; McMahon & Kolstrup,1979)。虽然吡喹酮治疗较好(Doenhoff et al.,2008)，但该药对预防血吸虫再感染的效果较差，而且从开有 30 年的历史 (Balen et al.,2007; Fenwick & Webster,2006)。寄生虫学者担心这可能使血吸虫在药物选择压力下产生耐药性。因此，发展血吸虫疫苗是综合防具有前瞻性的工作。化学药物治疗和疫苗预防相结合的方法是防控血吸虫病的向。
酸和一氧化氮。NOS 分为三种类型，包括诱导性一氧化氮合酶（inducible NOS）、神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS）和 内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS）。其中，iNOS 并不能持续表达，它能够在磷酸脂多糖（LPS）、磷脂酸（LTA）、肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、IL-1 和 IL-2。其中，它所产生的 NO 在机体内参与多种生理反应。一氧化氮在先天性免疫反应中具有重要作用能够清除利曼氏原虫，沙门氏菌和大肠杆菌等微生物 (Chakravortty et al., 2003)。研究表明胞内和胞外精氨酸的浓度是 NO 合成过程中一种重要的限速因子 (Wu et al., 1998)，精氨酸酶可通过与NOS 竞争消耗性底物精氨酸来调节 NO 的生成物（图 1.3）。精氨酸酶的 Km 值在 mM 的范围内而一氧化氮合酶的在 μM 范围内，这表明精氨酸酶的最大初速度是一氧化氮合酶的 1000 倍。cAMP、LPS、Th2 型的细胞因子譬如 IL-4 和 IL-13、TGF-β ，他们能够诱导巨噬细胞内精氨酸酶1 型的表达。而 Th1 型细胞因子譬如 IFN-γ 通过诱导巨噬细胞表达 NOS2 产生 NO，并且能够抑制 IL-4 和 IL-10 驱动的精氨酸酶 1 的表达。IL-4 和 IL-13 这些 Th2 型的细胞因子选择性活化能够抑制 NOS2 的功能，诱导巨噬细胞表达精氨酸酶 1 型，提高体液免疫，组织修复以及抗寄生虫的反应。此外，精氨酸酶产生的多按类物质能偶抑制那些会导致炎症的因子的产生。精氨酸酶被激活产生的脯氨酸，能够使胶原沉积，因此能够在炎症的地方进行组织修复（Shearer et al., 1997）。因此，精氨酸酶和一氧化氮合酶竞争性的关系，对 NO 产生的量影响巨大，这也决定也入侵的病原体的存亡。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Sj26和Sj23基因转染树突状细胞联合抗血吸虫感染的研究[J]. 沈定文,罗金萍,李雍龙,刘文琪. 中国人兽共患病学报. 2008(10)
[2]日本血吸虫精氨酸酶新基因的鉴定及作为疫苗的保护性研究[J]. 李孜,余新炳,吴忠道,胡旭初. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2006(02)
[3]噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用[J]. 王欣之,傅志强. 中国兽医寄生虫病. 2005(01)
[4]噬菌体表达短肽模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的研究[J]. 周东明,曾宪芳,王敏,Larry McReynold,易新元. 中国人兽共患病杂志. 2002(01)
[5]血吸虫疫苗研究面临的问题[J]. 李焱. 国外医学(寄生虫病分册). 1999(03)
[6]紫外线减毒尾蚴疫苗预防BALB/C小鼠日本血吸虫病的研究[J]. 沈际佳,蒋作君,汪学龙,江宝玲. 中国公共卫生. 1998(01)
[7]日本血吸虫精氨酸酶的研究[J]. 陶义训,黄左钺. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 1964(02)
本文编号：3338159
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