鸡沙门氏菌病检测方法的建立及初步应用
发布时间：2021-08-14 14:17
鸡沙门氏菌病由一种或多种血清型沙门氏菌引起鸡最常见的一种传染病,根据抗原结构主要分为鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒,严重威胁着养禽业的发展。为此,针对该病研制出快速、特异、灵敏高的检测方法迫在眉睫。本课题主要开展的研究工作如下:目的:（1）了解新疆北疆部分地区大型种鸡场鸡沙门氏菌病主要流行血清型和耐药情况。（2）以鸡沙门氏菌特异性靶基因inv A为诊断标记物,基于分子生物学方法和免疫胶体金技术,建立了鸡沙门氏菌套式PCR方法、环介导等温扩增联合横向侧流试纸（LAMP-LFD）方法和免疫胶体金试纸条,并对该方法的检测效果进行评价。方法:（1）采用平板凝集试验对新疆北疆部分地区大型种鸡场采集的750份临床样品进行检测,并对疑似鸡沙门氏菌病的病鸡进行细菌的分离鉴定、血清型鉴定和病理剖检方法。最后,用PCR方法进行确诊,并对分离的鸡沙门氏菌进行耐药性检测。（2）根据鸡沙门氏菌侵袭蛋白invA基因,设计两对特异性引物,分别作为外引物和内引物;以第一轮PCR的产物作为第二轮PCR反应的模板,建立鸡沙门氏菌病套式PCR方法,同时进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。（3）依据鸡沙门氏菌侵袭蛋白invA高...
【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
临床标本中分离和鉴定沙门氏菌病一些血清型的程序Fig.1Theprocedureforseparatingandidentifyingsomeserotypesofsalmonellosisinclinicalspecimens2.2分子生物学方法
板进行 PCR 反应。PCR 反应体系 20 μL：模板 1.5 μL，2 × ES Taq Master Mix 10 μL下游引物各 0.3 μL，ddH2O 补至 20 μL。PCR 反应条件：95℃预变性 5 min；95℃ 40 s，59℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min 50 s，30 个循环；72 ℃终延伸 10 min。PC进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 药敏试验根据 CLSI（2016）[68]进行操作，将分离到的鸡沙门氏菌纯化培养后，接种到 200 m-肉汤培养基中，37℃培养 24 h 后，按照 CLSI 推荐的肉汤稀释法进行，并用大肠菌标准菌株（ATCC 25922）作为质控菌[69]，进行药敏试验。取稀释好的菌液 500 μ到 20 cm 的营养琼脂平板上，均匀涂布平板。选取 24 种常用抗生素药敏片，无菌下，贴于平板中央，于 37℃培养 14～17 h 后按照药敏片的说明书判定抑菌结果。结果平板凝集试验结果对 750 份血液样品进行平板凝集试验，按照鸡沙门氏菌多价染色平板凝集试验抗原书上的判定要求进行判定，结果有 69 份呈阳性凝集（图 1-1），其中大多数为 100%＋＋＋）凝集和 75%凝集（＋＋＋），少部分出现 50%凝集（＋＋），其感染率为，表明该地区种鸡场感染鸡沙门氏菌病相当严重。
鸡沙门氏菌病检测方法的建立及初步应用半透明的菌落；HE 培养基上为无的圆形菌落，大部分菌落中心呈黑齐的菌落，颜色与培养基颜色相近心略带黑色、圆整、湿润和光滑的菌的絮状物，轻轻摇晃后变为白色沉中心的半透明菌落。革兰氏染色镜，两端钝圆，大小为 0.8～1.6 μm×
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析[J]. 刘志科,杨宁宁,徐锦凤,徐明国,荆明龙,吴文星,曹旭东,任艳,石峰,陈创夫. 中国畜牧兽医. 2017(09)
[2]鸡白痢的临床症状、实验室诊断与防治措施[J]. 郑保利. 现代畜牧科技. 2017(09)
[3]畜禽沙门氏菌病防制研究进展[J]. 张璐,张雪伟,袁宗辉,黄玲利,王玉莲. 中国畜牧兽医. 2017(07)
[4]沙门氏菌分子生物学检测方法研究进展[J]. 董冠波,孙岩,程小果. 饲料与畜牧. 2017(09)
[5]7株土鸡源鸡白痢沙门菌的分离鉴定[J]. 焦凤超,李迎晓,赵灿,聂仁红,赵瑜,刘锦妮,李洵,易本弛. 畜牧与兽医. 2017(04)
[6]沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制与应用[J]. 彭喆,王莉莉,朱晓琳,时建立,韩红,刘畅,徐胜男,张玲玲,李俊,黄保华. 家畜生态学报. 2016(12)
[7]鸡肉源沙门氏菌血清型、药敏性及部分耐药基因研究[J]. 王嘉炜,肖英平,杨华,曹晨阳,杨保伟. 食品科学. 2017(15)
[8]LAMP-LFD技术及其在生物快检方面应用[J]. 黄海龙,朱鹏,杨浩. 中国生物工程杂志. 2015(12)
[9]鸡源致病性沙门氏菌的分离鉴定及血清型和药物敏感性分析[J]. 施开创,李凤梅,邹联斌,许心婷,王海清,钟诚. 中国畜牧兽医. 2015(08)
[10]浅析鸡白痢病的诊断及防治方法[J]. 刘洪涛. 中兽医学杂志. 2015(08)
博士论文
[1]沙门氏菌及其致病性血清型分子检测技术研究及在食品中的应用[D]. 翟立公.南京农业大学 2015
硕士论文
[1]检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR试剂盒研制[D]. 栾云艳.黑龙江八一农垦大学 2016
[2]湖北省鸡源沙门氏菌的分离鉴定和耐药性分析[D]. 方翟.华中农业大学 2014
[3]布鲁氏菌病与莱姆病胶体金免疫层析试纸条的研制[D]. 程婷婷.石河子大学 2014
[4]华东地区鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定、分子流行病学及致病性研究[D]. 查华.扬州大学 2013
[5]沙门氏菌富集及ELISA检测方法的研究[D]. 牛瑞江.南昌大学 2012
[6]广西猪源沙门氏菌的分离鉴定及其生物学特性的研究[D]. 黄福标.广西大学 2012
[7]鸡伤寒沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感性试验[D]. 刘素英.西北农林科技大学 2011
[8]鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及微量平板凝集抗原的制备[D]. 张永第.西北农林科技大学 2010
[9]肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门氏菌快速检测方法的建立[D]. 孙红丽.山西农业大学 2005
[10]胶体金技术在鸡白痢/鸡伤寒检疫和沙门氏菌O9抗原检测中的应用研究[D]. 曹春梅.扬州大学 2004
本文编号：3342619
【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
临床标本中分离和鉴定沙门氏菌病一些血清型的程序Fig.1Theprocedureforseparatingandidentifyingsomeserotypesofsalmonellosisinclinicalspecimens2.2分子生物学方法
板进行 PCR 反应。PCR 反应体系 20 μL：模板 1.5 μL，2 × ES Taq Master Mix 10 μL下游引物各 0.3 μL，ddH2O 补至 20 μL。PCR 反应条件：95℃预变性 5 min；95℃ 40 s，59℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min 50 s，30 个循环；72 ℃终延伸 10 min。PC进行 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 药敏试验根据 CLSI（2016）[68]进行操作，将分离到的鸡沙门氏菌纯化培养后，接种到 200 m-肉汤培养基中，37℃培养 24 h 后，按照 CLSI 推荐的肉汤稀释法进行，并用大肠菌标准菌株（ATCC 25922）作为质控菌[69]，进行药敏试验。取稀释好的菌液 500 μ到 20 cm 的营养琼脂平板上，均匀涂布平板。选取 24 种常用抗生素药敏片，无菌下，贴于平板中央，于 37℃培养 14～17 h 后按照药敏片的说明书判定抑菌结果。结果平板凝集试验结果对 750 份血液样品进行平板凝集试验，按照鸡沙门氏菌多价染色平板凝集试验抗原书上的判定要求进行判定，结果有 69 份呈阳性凝集（图 1-1），其中大多数为 100%＋＋＋）凝集和 75%凝集（＋＋＋），少部分出现 50%凝集（＋＋），其感染率为，表明该地区种鸡场感染鸡沙门氏菌病相当严重。
鸡沙门氏菌病检测方法的建立及初步应用半透明的菌落；HE 培养基上为无的圆形菌落，大部分菌落中心呈黑齐的菌落，颜色与培养基颜色相近心略带黑色、圆整、湿润和光滑的菌的絮状物，轻轻摇晃后变为白色沉中心的半透明菌落。革兰氏染色镜，两端钝圆，大小为 0.8～1.6 μm×
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡白痢沙门氏菌病原的分离鉴定及耐药性分析[J]. 刘志科,杨宁宁,徐锦凤,徐明国,荆明龙,吴文星,曹旭东,任艳,石峰,陈创夫. 中国畜牧兽医. 2017(09)
[2]鸡白痢的临床症状、实验室诊断与防治措施[J]. 郑保利. 现代畜牧科技. 2017(09)
[3]畜禽沙门氏菌病防制研究进展[J]. 张璐,张雪伟,袁宗辉,黄玲利,王玉莲. 中国畜牧兽医. 2017(07)
[4]沙门氏菌分子生物学检测方法研究进展[J]. 董冠波,孙岩,程小果. 饲料与畜牧. 2017(09)
[5]7株土鸡源鸡白痢沙门菌的分离鉴定[J]. 焦凤超,李迎晓,赵灿,聂仁红,赵瑜,刘锦妮,李洵,易本弛. 畜牧与兽医. 2017(04)
[6]沙门氏菌胶体金免疫层析试纸条的研制与应用[J]. 彭喆,王莉莉,朱晓琳,时建立,韩红,刘畅,徐胜男,张玲玲,李俊,黄保华. 家畜生态学报. 2016(12)
[7]鸡肉源沙门氏菌血清型、药敏性及部分耐药基因研究[J]. 王嘉炜,肖英平,杨华,曹晨阳,杨保伟. 食品科学. 2017(15)
[8]LAMP-LFD技术及其在生物快检方面应用[J]. 黄海龙,朱鹏,杨浩. 中国生物工程杂志. 2015(12)
[9]鸡源致病性沙门氏菌的分离鉴定及血清型和药物敏感性分析[J]. 施开创,李凤梅,邹联斌,许心婷,王海清,钟诚. 中国畜牧兽医. 2015(08)
[10]浅析鸡白痢病的诊断及防治方法[J]. 刘洪涛. 中兽医学杂志. 2015(08)
博士论文
[1]沙门氏菌及其致病性血清型分子检测技术研究及在食品中的应用[D]. 翟立公.南京农业大学 2015
硕士论文
[1]检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR试剂盒研制[D]. 栾云艳.黑龙江八一农垦大学 2016
[2]湖北省鸡源沙门氏菌的分离鉴定和耐药性分析[D]. 方翟.华中农业大学 2014
[3]布鲁氏菌病与莱姆病胶体金免疫层析试纸条的研制[D]. 程婷婷.石河子大学 2014
[4]华东地区鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定、分子流行病学及致病性研究[D]. 查华.扬州大学 2013
[5]沙门氏菌富集及ELISA检测方法的研究[D]. 牛瑞江.南昌大学 2012
[6]广西猪源沙门氏菌的分离鉴定及其生物学特性的研究[D]. 黄福标.广西大学 2012
[7]鸡伤寒沙门氏菌的分离鉴定及药物敏感性试验[D]. 刘素英.西北农林科技大学 2011
[8]鸡白痢沙门氏菌的分离鉴定及微量平板凝集抗原的制备[D]. 张永第.西北农林科技大学 2010
[9]肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门氏菌快速检测方法的建立[D]. 孙红丽.山西农业大学 2005
[10]胶体金技术在鸡白痢/鸡伤寒检疫和沙门氏菌O9抗原检测中的应用研究[D]. 曹春梅.扬州大学 2004
本文编号：3342619
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