CSFV/BVDV双重荧光RT-PCR检测方法的建立与山东地区CSFV的分子生物学研究
发布时间：2021-08-19 20:55
猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高度接触性致死性传染病,现阶段,猪瘟的防控通常采用猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）进行接种预防,该疫苗是世界上公认的最有效和安全的弱毒疫苗,对猪瘟的防控起到了重要的作用。然而,在免疫良好的猪场仍有猪瘟的病例的发生,CSFV与牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）同属于黄病毒科、瘟病毒属,存在抗原相关性和交叉反应性,两者自然条件下感染猪,其临床症状和病理变化相似,加大了临床诊断的困难。为了解山东地区CSFV的流行状况和更好地进行CSFV的监测,本试验建立了双重荧光RT-PCR（RT-qPCR）检测方法,并对成功分离的CSFV的C、E0、E1基因和E2部分基因进行了克隆测序和遗传进化分析。为建立CSFV和BVDV的鉴别检测方法,根据Genbank公布的基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,以构建的CSFV Npro和BVDV 5′-UTR的阳性重组质粒作为阳性质控品,优化反应条件,建立了双重RT-qPC...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BVDV5′-UTR基因的RT-PCR扩增Fig.2RT-PCRamplificationofBVDVgene5′-UTR
CSFV/BVDV 双重 RT-qPCR 方法建立的结果1 阳性质控品的制备及浓度确定通过 RT-PCR 获得了 CSFV Npro和 BVDV 5′-UTR 区域，为 592bp 和，与预期大小一致（图 1 和图 2）。将构建的重组质粒转化入 DH5α提取质粒进行测序。测序正确后，选用限制性内切酶，对 30μl 质粒将 DNA 片段进行回收，溶于 30μl Nuclease-Free 水中作为模板，用 Pro MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7 试剂盒进行体外转录温浴 5 小时。之后向反应体系中加入 10μl RQ1 DNA 酶，37℃温育 A 模板。最后用 TRIZOL 重新提取纯化 RNA，以去除体系中的杂蛋白 cDNA 浓度分别为 1.5x1011/μl (CSFV)、8.2x1010/μl（BVDV）。将用稀释液稀释成 108copies/μl 后，作为阳性质控品。
山东农业大学全日制硕士专业学位论文反应条件为：反转录 42℃ 30min；预变性 94℃ 3min；92℃ 15s，45℃ 30s，1min ，5 个循环；92℃ 10s，56℃ 1min（收集荧光），40 个循环。标准曲线建立，将连续 10 倍倍比稀释的 CSFV 和 BVDV 阳性质控品（cDNA分别为 106、105、104、103、102/μl）用建立的荧光 RT-PCR 检测方法进行检测，采光 PCR 仪软件 Roche LightCycler Softwire Version3.5 对 Ct 值和样品中 cDNA 的量线性回归分析，建立标准曲线，其中 CSFV、BVDV 的相关系数 R2=0.99(图 3 和图BVDV-F（10μmol/ L） 0.5μlBVDV-R（10μmol/ L） 1μlBVDV-Probe（10μmol/ L） 0.5μlDEPC H2O 2.75μlRNA 模板 10μl
【参考文献】：
期刊论文
[1]2016年猪病流行情况与2017年流行趋势及防控对策[J]. 杨汉春,周磊. 猪业科学. 2017(02)
[2]猪瘟病毒检测方法研究进展[J]. 诸婷婷,郝彦龙,袁小平,但文静,唐维英. 甘肃畜牧兽医. 2017(01)
[3]福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析[J]. 魏春华,刘建奎,戴爱玲,曾宇坤,李晓华,杨小燕. 中国兽医学报. 2016(12)
[4]猪瘟病毒E0和E2基因变异及猪瘟净化方法的研究[J]. 韦冠东,马萍,汤德元,张元鑫,刘霞,曾智勇,李达,李谦. 猪业科学. 2016(06)
[5]猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析[J]. 孙永科,胡超英,林明星,陆欣然,杨玉艾. 动物医学进展. 2016(06)
[6]猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定[J]. 周景明,刘芳冰,祁艳华,张改平,栗宁,王爱萍. 安徽农业科学. 2016(10)
[7]仔猪猪瘟母源抗体的消长规律及免疫程序制定[J]. 姚俊庸,吉艺宽,郑仲华. 广东畜牧兽医科技. 2016(02)
[8]猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测与分析[J]. 张志,张美晶,董雅琴,王佳,吴发兴,刘爽,邵卫星,李晓成,王树双. 中国动物检疫. 2015(11)
[9]猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主细胞核仁素蛋白相互作用[J]. 张鑫,时洪艳,徐佳. 中国预防兽医学报. 2015(06)
[10]一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用[J]. 袁秀芳,路斌,徐丽华,李军星,王一成. 浙江农业学报. 2015(04)
博士论文
[1]规模化猪场猪瘟疫苗群体免疫程序的研究[D]. 陈果亮.湖南农业大学 2013
[2]我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究[D]. 邓宇.四川农业大学 2012
[3]中国猪瘟流行病学现状与防制研究[D]. 涂长春.中国农业大学 2004
[4]中国猪瘟兔化弱毒（脾淋毒）全长感染性cDNA的分子克隆[D]. 胡建和.西北农林科技大学 2003
[5]猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D]. 韩雪清.西北农林科技大学 2002
硕士论文
[1]CSFV、BVDV双重RT-PCR检测方法的建立及E2基因遗传进化分析[D]. 秦为坚.华南农业大学 2016
[2]2014-2015年我国猪瘟病毒的分子流行病学分析[D]. 冯丽苹.长江大学 2016
[3]泰安某猪场猪瘟病毒的检测及疫苗免疫效果评价[D]. 朱应平.山东农业大学 2016
[4]鉴别GSFV与BVDV1双重实时荧光定量PCR方法的建立[D]. 海日汗.内蒙古农业大学 2015
[5]猪瘟病毒核衣壳蛋白C亚细胞定位信号的鉴定[D]. 刘宁.吉林农业大学 2014
[6]广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查[D]. 彭志成.山东农业大学 2013
[7]2012年猪瘟E2基因分子流行病学调查及重组病毒构建[D]. 王赛赛.福建农林大学 2013
[8]山东省猪瘟流行病学调查及流行毒株Erns基因变异分析[D]. 党安坤.山东农业大学 2012
[9]猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建[D]. 蒙明璐.南京农业大学 2012
[10]猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和非结构蛋白Npro、NS4A的原核表达及纯化[D]. 高璐璐.中国人民解放军军事医学科学院 2011
本文编号：3352129
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BVDV5′-UTR基因的RT-PCR扩增Fig.2RT-PCRamplificationofBVDVgene5′-UTR
CSFV/BVDV 双重 RT-qPCR 方法建立的结果1 阳性质控品的制备及浓度确定通过 RT-PCR 获得了 CSFV Npro和 BVDV 5′-UTR 区域，为 592bp 和，与预期大小一致（图 1 和图 2）。将构建的重组质粒转化入 DH5α提取质粒进行测序。测序正确后，选用限制性内切酶，对 30μl 质粒将 DNA 片段进行回收，溶于 30μl Nuclease-Free 水中作为模板，用 Pro MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7 试剂盒进行体外转录温浴 5 小时。之后向反应体系中加入 10μl RQ1 DNA 酶，37℃温育 A 模板。最后用 TRIZOL 重新提取纯化 RNA，以去除体系中的杂蛋白 cDNA 浓度分别为 1.5x1011/μl (CSFV)、8.2x1010/μl（BVDV）。将用稀释液稀释成 108copies/μl 后，作为阳性质控品。
山东农业大学全日制硕士专业学位论文反应条件为：反转录 42℃ 30min；预变性 94℃ 3min；92℃ 15s，45℃ 30s，1min ，5 个循环；92℃ 10s，56℃ 1min（收集荧光），40 个循环。标准曲线建立，将连续 10 倍倍比稀释的 CSFV 和 BVDV 阳性质控品（cDNA分别为 106、105、104、103、102/μl）用建立的荧光 RT-PCR 检测方法进行检测，采光 PCR 仪软件 Roche LightCycler Softwire Version3.5 对 Ct 值和样品中 cDNA 的量线性回归分析，建立标准曲线，其中 CSFV、BVDV 的相关系数 R2=0.99(图 3 和图BVDV-F（10μmol/ L） 0.5μlBVDV-R（10μmol/ L） 1μlBVDV-Probe（10μmol/ L） 0.5μlDEPC H2O 2.75μlRNA 模板 10μl
【参考文献】：
期刊论文
[1]2016年猪病流行情况与2017年流行趋势及防控对策[J]. 杨汉春,周磊. 猪业科学. 2017(02)
[2]猪瘟病毒检测方法研究进展[J]. 诸婷婷,郝彦龙,袁小平,但文静,唐维英. 甘肃畜牧兽医. 2017(01)
[3]福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析[J]. 魏春华,刘建奎,戴爱玲,曾宇坤,李晓华,杨小燕. 中国兽医学报. 2016(12)
[4]猪瘟病毒E0和E2基因变异及猪瘟净化方法的研究[J]. 韦冠东,马萍,汤德元,张元鑫,刘霞,曾智勇,李达,李谦. 猪业科学. 2016(06)
[5]猪瘟病毒石门株在ST细胞连续传代后E0基因变异分析[J]. 孙永科,胡超英,林明星,陆欣然,杨玉艾. 动物医学进展. 2016(06)
[6]猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定[J]. 周景明,刘芳冰,祁艳华,张改平,栗宁,王爱萍. 安徽农业科学. 2016(10)
[7]仔猪猪瘟母源抗体的消长规律及免疫程序制定[J]. 姚俊庸,吉艺宽,郑仲华. 广东畜牧兽医科技. 2016(02)
[8]猪用疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染的检测与分析[J]. 张志,张美晶,董雅琴,王佳,吴发兴,刘爽,邵卫星,李晓成,王树双. 中国动物检疫. 2015(11)
[9]猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主细胞核仁素蛋白相互作用[J]. 张鑫,时洪艳,徐佳. 中国预防兽医学报. 2015(06)
[10]一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用[J]. 袁秀芳,路斌,徐丽华,李军星,王一成. 浙江农业学报. 2015(04)
博士论文
[1]规模化猪场猪瘟疫苗群体免疫程序的研究[D]. 陈果亮.湖南农业大学 2013
[2]我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒研究[D]. 邓宇.四川农业大学 2012
[3]中国猪瘟流行病学现状与防制研究[D]. 涂长春.中国农业大学 2004
[4]中国猪瘟兔化弱毒（脾淋毒）全长感染性cDNA的分子克隆[D]. 胡建和.西北农林科技大学 2003
[5]猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D]. 韩雪清.西北农林科技大学 2002
硕士论文
[1]CSFV、BVDV双重RT-PCR检测方法的建立及E2基因遗传进化分析[D]. 秦为坚.华南农业大学 2016
[2]2014-2015年我国猪瘟病毒的分子流行病学分析[D]. 冯丽苹.长江大学 2016
[3]泰安某猪场猪瘟病毒的检测及疫苗免疫效果评价[D]. 朱应平.山东农业大学 2016
[4]鉴别GSFV与BVDV1双重实时荧光定量PCR方法的建立[D]. 海日汗.内蒙古农业大学 2015
[5]猪瘟病毒核衣壳蛋白C亚细胞定位信号的鉴定[D]. 刘宁.吉林农业大学 2014
[6]广东省部分地区猪瘟分子流行病学调查[D]. 彭志成.山东农业大学 2013
[7]2012年猪瘟E2基因分子流行病学调查及重组病毒构建[D]. 王赛赛.福建农林大学 2013
[8]山东省猪瘟流行病学调查及流行毒株Erns基因变异分析[D]. 党安坤.山东农业大学 2012
[9]猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建[D]. 蒙明璐.南京农业大学 2012
[10]猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和非结构蛋白Npro、NS4A的原核表达及纯化[D]. 高璐璐.中国人民解放军军事医学科学院 2011
本文编号：3352129
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