猪流行性腹泻—传染性胃肠炎二联灭活疫苗的研制及对小鼠的免疫原性研究
发布时间：2021-08-20 16:16
自2010年以来，猪流行性腹泻在东南亚国家爆发，哺乳仔猪呈高发病率、高死亡率，经济损失严重。目前东南亚、德国及美国都有PED爆发的报道。在发生流行性腹泻的猪群中，猪传染性胃肠炎病毒也有相当高的检出率。对中国流行性腹泻病毒的基因水平研究显示，引起此次流行性腹泻暴发的毒株与我国长期使用的猪流行腹泻疫苗株XXX株有较大差异，尤其是纤突（S）蛋白的N端。此外，XXX株疫苗免疫猪群中依然发生猪流行性腹泻，提示现有疫苗不能给猪群提供完全免疫保护。本论文原核表达猪流行腹泻病毒中国分离株A/C的S基因N端高变区，并将纯化的S蛋白融合到基于XXX株疫苗株的猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗，对所制备二联苗的免疫原性进行了研究，为进一步研制有效防控猪流行性腹泻流行株引起的腹泻和猪传染性胃肠炎的高效疫苗奠定基础。1. PEDV间接ELISA抗体检测方法的建立将表达PEDV XXX株疫苗株S基因N端1077bp（YSA）的PET-28a重组阳性菌在37℃的条件下加入IPTG进行诱导表达，经SDS-PAGE分析表明该蛋白获得了高效表达，表达的蛋白为42KD，且主要以融合蛋白的形式表达。Western bl...
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒在BL21中的表达、目的蛋白的纯化
图 2 PEDV 在 Vero 细胞上的病毒滴度动态曲线igure 2 The dynamic curves of virus titers of PEDV in Vero cells以看出，按 XXX 接毒时，细胞长满单层时在 48 小时收毒时病毒滴度稍高于90%时接毒，在细胞长满单层接毒时，按 XXX 接毒时病毒滴度稍高于按 XXXV 增殖条件为在细胞长满单层时按 XXX 时接毒。收获的 PEDV 病毒含量为化结果体的洗涤及纯化，能获得较纯的无标签的 SA 蛋白，用于疫苗的制备（见图灭活效果的检验猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒液病分别接种于 PK-15 细胞和 Vero 细，无细胞病变，说明病毒灭活彻底。检验2 结果
图 3 LSA 蛋白表达纯化结果M.低分子量蛋白 Marker，1.未经诱导的含空质 BL21 菌，2.诱导的含空质粒 BL21 菌，3.未经诱导的含重组4. 诱导的含重组质粒 BL21 菌，5.经镍柱纯化的 LSA 蛋白Figure 3 SDS-PAGE of recombinant protein expression：Protein molecμLar weight Marker; lane1.pBV220-LSA/BL21 induced by IPTG; lane 2not induced by IPTG; lane 3. purified purified recombinant LSA prote5.1.4 黏度检验 用 1 mL 吸管（下口内径为 1.2 mm，上口内径为 2.7右的疫苗，令其垂直自然流出，流出 0.4 mL 所需时间未超过 4 s。5.2 无菌检验 按《中国兽药典》进行无菌检验，结果制备的疫苗无杂没有菌落生长。5.3 疫苗的小鼠安全性试验制备的猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗免疫小鼠后，观
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 霍金耀,郑逢梅,陈陆,余秋颖,常洪涛,陈文定,明星,郑关民,赵军,王川庆. 中国兽医学报. 2013(12)
[2]2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J]. 郑逢梅,霍金耀,赵军,常洪涛,王晓梦,陈陆,王川庆. 病毒学报. 2013(02)
[3]猪流行性腹泻的诊断与预防[J]. 王靓靓,李训良,李鹏冲,任晓峰. 世界华人消化杂志. 2013(01)
[4]PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达[J]. 廖晓丹,曹三杰,黄小波,唐莹,文心田. 中国兽医学报. 2012(05)
[5]猪传染性胃肠炎病毒陕西株的分离鉴定[J]. 丁利,陈光达,许信刚,童德文. 中国兽医杂志. 2011(10)
[6]TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达[J]. 王劭,陈少莺,朱小丽,程晓霞,林锋强,陈仕龙,李兆龙,朱晓琳. 福建农业学报. 2011(01)
[7]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经. 生物工程学报. 2009(06)
[8]携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析[J]. 杨恒,刘佳文,曹三杰,黄小波,文心田. 微生物学报. 2009(01)
[9]表达猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析[J]. 唐丽杰,欧笛,葛俊伟,徐义刚,李一经,史达,夏春丽,郁茵. 微生物学报. 2007(02)
[10]猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力[J]. 任晓峰,尹杰超,司微,李一经,刘宝全. 中国兽医科学. 2006(03)
本文编号：3353817
【文章来源】：河南农业大学河南省
【文章页数】：46 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
重组质粒在BL21中的表达、目的蛋白的纯化
图 2 PEDV 在 Vero 细胞上的病毒滴度动态曲线igure 2 The dynamic curves of virus titers of PEDV in Vero cells以看出，按 XXX 接毒时，细胞长满单层时在 48 小时收毒时病毒滴度稍高于90%时接毒，在细胞长满单层接毒时，按 XXX 接毒时病毒滴度稍高于按 XXXV 增殖条件为在细胞长满单层时按 XXX 时接毒。收获的 PEDV 病毒含量为化结果体的洗涤及纯化，能获得较纯的无标签的 SA 蛋白，用于疫苗的制备（见图灭活效果的检验猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒液病分别接种于 PK-15 细胞和 Vero 细，无细胞病变，说明病毒灭活彻底。检验2 结果
图 3 LSA 蛋白表达纯化结果M.低分子量蛋白 Marker，1.未经诱导的含空质 BL21 菌，2.诱导的含空质粒 BL21 菌，3.未经诱导的含重组4. 诱导的含重组质粒 BL21 菌，5.经镍柱纯化的 LSA 蛋白Figure 3 SDS-PAGE of recombinant protein expression：Protein molecμLar weight Marker; lane1.pBV220-LSA/BL21 induced by IPTG; lane 2not induced by IPTG; lane 3. purified purified recombinant LSA prote5.1.4 黏度检验 用 1 mL 吸管（下口内径为 1.2 mm，上口内径为 2.7右的疫苗，令其垂直自然流出，流出 0.4 mL 所需时间未超过 4 s。5.2 无菌检验 按《中国兽药典》进行无菌检验，结果制备的疫苗无杂没有菌落生长。5.3 疫苗的小鼠安全性试验制备的猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻二联灭活疫苗免疫小鼠后，观
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、A群轮状病毒和嵴病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 霍金耀,郑逢梅,陈陆,余秋颖,常洪涛,陈文定,明星,郑关民,赵军,王川庆. 中国兽医学报. 2013(12)
[2]2010～2012年华中地区猪流行性腹泻病毒分子特征和遗传进化分析[J]. 郑逢梅,霍金耀,赵军,常洪涛,王晓梦,陈陆,王川庆. 病毒学报. 2013(02)
[3]猪流行性腹泻的诊断与预防[J]. 王靓靓,李训良,李鹏冲,任晓峰. 世界华人消化杂志. 2013(01)
[4]PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达[J]. 廖晓丹,曹三杰,黄小波,唐莹,文心田. 中国兽医学报. 2012(05)
[5]猪传染性胃肠炎病毒陕西株的分离鉴定[J]. 丁利,陈光达,许信刚,童德文. 中国兽医杂志. 2011(10)
[6]TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达[J]. 王劭,陈少莺,朱小丽,程晓霞,林锋强,陈仕龙,李兆龙,朱晓琳. 福建农业学报. 2011(01)
[7]表面表达猪流行性腹泻病毒核蛋白蛋白的重组干酪乳杆菌诱导产生的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经. 生物工程学报. 2009(06)
[8]携带TGEV DNA疫苗减毒沙门氏菌的构建及安全性与免疫性分析[J]. 杨恒,刘佳文,曹三杰,黄小波,文心田. 微生物学报. 2009(01)
[9]表达猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析[J]. 唐丽杰,欧笛,葛俊伟,徐义刚,李一经,史达,夏春丽,郁茵. 微生物学报. 2007(02)
[10]猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力[J]. 任晓峰,尹杰超,司微,李一经,刘宝全. 中国兽医科学. 2006(03)
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