锌指抗病毒蛋白限制小反刍病毒复制的分子机制
发布时间：2021-08-21 01:54
小反刍兽疫（peste des petits ruminants,PPR）,俗称羊瘟,是由小反刍动物病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起急性、高度传染性的病毒性疾病,主要发生于山羊、绵羊和骆驼等反刍动物。其病原PPRV是副黏病毒科,麻疹病毒属的成员。PPRV的基因组大小为15948 nt,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白。PPRV在羊源细胞中难以稳定的增殖,导致了PPRV天然免疫和致病机制方面的研究相对滞后。宿主限制因子是天然免疫系统的一部分,是宿主进化形成的抵抗病原微生物感染的早期防线。目前已经发现了多种限制性因子,其中就包括锌指抗病毒蛋白（Zinc finger antiviral protein,ZAP）。ZAP是由ISG ZC3HAV1基因编码表达的一种宿主限制因子,对多种病毒具有明显的抑制作用,在天然免疫过程中发挥了重要作用。目前,关于羊源ZAP（ovis aries ZAP,oZAP）的抗病毒研究较少,尤其是与PPRV感染之间的关系尚未见报道。为此,本论文首先克隆了羊源ZAP,并探索了ZAP在PPRV感染和复制过程中的作用及...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
麻疹病毒基因组和颗粒结构(PFEFFERMANNetal.,2018)
中国农业科学院硕士学位论文第二章羊源ZAP的克隆与序列分析12PCR反应体系为：模板DNA（120ng/ul)2.0μL,exTaqMix25μL,上下游引物（10mM)各2μL，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR扩增条件为：95℃3min;95℃1min,58℃30s,72℃3min,34个循环；72℃延伸10min。同时设立阴性对照，不加模板。取PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行胶回收。2.2.3生物信息学分析利用ExPASy的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在线软件对oZAP蛋白的理化性质分析；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）预测oZAP基因编码蛋白的疏水性；分别利用NetPhos3.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测oZAP蛋白磷酸化位点和糖基化位点；分别利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org）预测蛋白结构；利用EMBL-EBL（https://www.embl.org）预测oZAP蛋白的功能结构域2.3实验结果2.3.1oZAP基因的获得从羊脾脏中提取的RNA经反转录为cDNA进行PCR扩增（图2-1）。对重组质粒进行菌液测序，得到了为2697bpZAP基因序列，测序结果与目的序列一致，同源性达到100%。图2-1oZAP基因的PCR扩增Fig.2-1PCRamplificationofoZAPgeneM:DNA分子量标准;1:空白对照;2:oZAP基因扩增产物M:DNAmarker;1.Blankcontrol;2:oZAPgeneamplificationproduct2679bp
彼幔⊿er）含量最高（11.0%），色氨酸（Trp）含量最低（1.3%）。该蛋白在体外理论半衰期为30h，不稳定系数为53.61，为不稳定蛋白；总脂肪酸为64.05，亲水总平均值为-0.605，属于亲水性蛋白。分别利用SignalP5.0Server和TMHMMServerv.2.0预测oZAP蛋白的信号肽和跨膜区，结果如图2-2A，oZAP蛋白C、Y、S平均值分别为0.193、0.171、0.311及0.194，该蛋白不存在跨膜区结构（图2-2B）。表明oZAP蛋白其不存在信号肽序列，可以高效表达。推测该蛋白可以较高量和可溶性表达，为获得可溶性的oZAP蛋白奠基了理论基矗图2-2oZAP蛋白信号肽和跨膜区结构预测（A）oZAP蛋白信号结构肽预测结果；（B）oZAP蛋白跨膜区结构预测结果Fig.2-2PredictionofoZAPproteinsignalpeptideandthetransmembranestructure(A)PredictionresultsofoZAPproteinsignalstructurepeptide;(B)PredictionresultsofoZAPproteintransmembranestructure运用NetPhos3.1Server和NetNGlyc1.0软件分别预测oZAP蛋白磷酸化位点和糖基化位点，结果显示，当潜在磷酸化位点的阈值为0.5时，oZAP蛋白存在114个潜在的磷酸化位点，其中包括77个丝氨酸位点、6个苏氨酸位点和12个酪氨酸位点（图2-3A）。oZAP蛋白含有5个糖基化位点，NGSA、NHSD、NDSV、NISF、NPSV分别为0.7017、0.5367、0.5439、0.6350、0.6106（图2-3B）。蛋白质在翻译后会经过适当的修饰形成成熟蛋白质，其中磷酸化和糖基化是自然界中重要的翻译后修饰。经过生物信息学分析，oZAP蛋白的5个糖基化位点可能对其功能具有重要作用。AB
本文编号：3354652
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：58 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
麻疹病毒基因组和颗粒结构(PFEFFERMANNetal.,2018)
中国农业科学院硕士学位论文第二章羊源ZAP的克隆与序列分析12PCR反应体系为：模板DNA（120ng/ul)2.0μL,exTaqMix25μL,上下游引物（10mM)各2μL，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR扩增条件为：95℃3min;95℃1min,58℃30s,72℃3min,34个循环；72℃延伸10min。同时设立阴性对照，不加模板。取PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒进行胶回收。2.2.3生物信息学分析利用ExPASy的ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在线软件对oZAP蛋白的理化性质分析；利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）预测oZAP基因编码蛋白的疏水性；分别利用NetPhos3.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）和NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）预测oZAP蛋白磷酸化位点和糖基化位点；分别利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org）预测蛋白结构；利用EMBL-EBL（https://www.embl.org）预测oZAP蛋白的功能结构域2.3实验结果2.3.1oZAP基因的获得从羊脾脏中提取的RNA经反转录为cDNA进行PCR扩增（图2-1）。对重组质粒进行菌液测序，得到了为2697bpZAP基因序列，测序结果与目的序列一致，同源性达到100%。图2-1oZAP基因的PCR扩增Fig.2-1PCRamplificationofoZAPgeneM:DNA分子量标准;1:空白对照;2:oZAP基因扩增产物M:DNAmarker;1.Blankcontrol;2:oZAPgeneamplificationproduct2679bp
彼幔⊿er）含量最高（11.0%），色氨酸（Trp）含量最低（1.3%）。该蛋白在体外理论半衰期为30h，不稳定系数为53.61，为不稳定蛋白；总脂肪酸为64.05，亲水总平均值为-0.605，属于亲水性蛋白。分别利用SignalP5.0Server和TMHMMServerv.2.0预测oZAP蛋白的信号肽和跨膜区，结果如图2-2A，oZAP蛋白C、Y、S平均值分别为0.193、0.171、0.311及0.194，该蛋白不存在跨膜区结构（图2-2B）。表明oZAP蛋白其不存在信号肽序列，可以高效表达。推测该蛋白可以较高量和可溶性表达，为获得可溶性的oZAP蛋白奠基了理论基矗图2-2oZAP蛋白信号肽和跨膜区结构预测（A）oZAP蛋白信号结构肽预测结果；（B）oZAP蛋白跨膜区结构预测结果Fig.2-2PredictionofoZAPproteinsignalpeptideandthetransmembranestructure(A)PredictionresultsofoZAPproteinsignalstructurepeptide;(B)PredictionresultsofoZAPproteintransmembranestructure运用NetPhos3.1Server和NetNGlyc1.0软件分别预测oZAP蛋白磷酸化位点和糖基化位点，结果显示，当潜在磷酸化位点的阈值为0.5时，oZAP蛋白存在114个潜在的磷酸化位点，其中包括77个丝氨酸位点、6个苏氨酸位点和12个酪氨酸位点（图2-3A）。oZAP蛋白含有5个糖基化位点，NGSA、NHSD、NDSV、NISF、NPSV分别为0.7017、0.5367、0.5439、0.6350、0.6106（图2-3B）。蛋白质在翻译后会经过适当的修饰形成成熟蛋白质，其中磷酸化和糖基化是自然界中重要的翻译后修饰。经过生物信息学分析，oZAP蛋白的5个糖基化位点可能对其功能具有重要作用。AB
本文编号：3354652
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