绵羊equatorin（赤道素）的cDNA克

发布时间：2021-08-22 07:26

　　哺乳动物的成功受精是动物的种族延续和基因进化的前提,精子与卵子的质膜粘附并融合是哺乳动物完成受精所必需的步骤。近年来,在很多学者利用现代分子生物学手段对精卵质膜粘附和融合过程进行的研究中发现,精卵融合是个多分子多受体的协调下共同参与发生的过程。现阶段普遍认为精卵融合的起始部位为精子膜赤道区,而对equatorin的研究起始于应用MN9单克隆抗体对精子上该蛋白的识别,而且体外注射MN9抗体能显著抑制精卵融合,初步猜想Eqtn为精卵融合相关蛋白。但是Eqtn究竟以何种方式参与顶体并最终介导精卵融合尚未知。本实验以内蒙古绵羊为实验动物,首先根据GenBank中已公布的相关物种Eqtn基因序列信息,对比其CDs区寻找保守序列,设计该基因的特异性引物。提取绵羊睾丸组织总RNA,通过反转录获得cDNA,以此为模板克隆Eqtn基因的cDNA,并测序。测序后,根据该cDNA的可参考序列,设计特异性引物克隆去掉信号肽后的基因片段（19aa-336aa）。将克隆得到的cDNA片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达质粒pGEX-Eqtn;将重组质粒PGEX-Eqtn转化E.coli BL21（... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
目录
第一部分 文献综述
    第一章 哺乳动物体内精卵融合机制的研究进展
        1. 哺乳动物的精卵融合机制
            1.1. 精卵识别
            1.2. 顶体反应
            1.3. 精卵融合
        2. 精卵融合的分子基础
            2.1. 卵膜表面分子
            2.2. 精子表面分子
        3. 精卵融合的生物学意义
    第二章 赤道素Eqtn的研究进展
        1. Eqtn的基本概况
            1.1. Eqtn的发现
            1.2. Eqtn的定位
        2. Eqtn的研究意义
第二部分 研究论文
    第一章 绵羊Eqtn cDNA的克隆及生物信息学分析
        前言
        1. 材料与方法
            1.1. 试验动物
            1.2. 仪器与试剂
                1.2.1. 实验仪器
                1.2.2. 试剂
                1.2.3. 克隆载体
                1.2.4. 菌种
                1.2.5. 试剂配制
                1.2.6. 器具处理
            1.3. 引物的合成与保存
                1.3.1. 特异性引物的设计与合成
                1.3.2. 引物的保存和稀释
            1.4. 实验方法
                1.4.1. 绵羊睾丸组织总RNA提取
                1.4.2. cDNA第一条链的合成
                1.4.3. β-actin检测模板
                1.4.4. PCR扩增
                1.4.5. 回收PCR产物
                1.4.6. 目的片段与T-载体的连接
                1.4.7. 转化与筛选
                1.4.8. 重组质粒T-Eqtn的鉴定
            1.5. Eqtn基因的生物信息学分析
                1.5.1. 结构预测与功能分析
                1.5.2. 分子系统进化分析
        2. 结果
            2.1. 绒山羊与绵羊睾丸组织总RNA的提取与鉴定
            2.2. 绒山羊与绵羊cDNA的β-actin检测
            2.3. 绒山羊Eqtn cDNA全长的PCR扩增
            2.4. 重组质粒的鉴定
            2.5. 分析测序结果
                2.5.1. 测序结果
                2.5.2. 核酸序列比对
                2.5.3. 氨基酸序列比对
            2.6. 绵羊Eqtn基因的生物信息学分析
                2.6.1. 结构预测与功能分析
                2.6.2. 分子系统进化分析
        3. 讨论
    第二章 重组蛋白GST-Eqtn蛋白的原核表达及纯化
        前言
        1. 材料与方法
            1.1. 仪器与试剂
                1.1.1. 实验仪器
                1.1.2. 实验试剂
                1.1.3. 常用试剂配制
                1.1.4. 菌种
                1.1.5. 载体
            1.2. 实验方法
                1.2.1. 引物设计与合成
                1.2.2. 扩增目的片段
                1.2.3. 电泳鉴定及产物回收
                1.2.4. 构建重组质粒PGEX-Eqtn
                1.2.5. 融合蛋白GST-Eqtn的原核表达
                1.2.6. 融合蛋白GST-Eqtn的SDS-PAGE电泳鉴定
                1.2.7. 融合蛋白GST-Eqtn的Western Bloting鉴定
                1.2.8. 融合蛋白GST-Eqtn的纯化与浓缩
                1.2.9. Bardford法测定纯化蛋白的浓度
        2. 结果
            2.1. 目的片段的克隆与回收
            2.2. 构建过渡载体T-Eqtn
            2.3. 构建表达载体PGEX-Eqtn
            2.4. 重组质粒的测序鉴定
            2.5. 融合蛋白GST-Eqtn的原核表达与纯化
            2.6. 融合蛋白GST-Eqtn的Western Bloting检测
            2.7. 融合蛋白GST-Eqtn的Bardford法浓度测定结果
        3. 讨论
    第三章 小鼠抗绒山羊GST-Eqtn腹水多克隆抗体的制备与检测
        前言
        1. 材料与方法
            1.1. 实验动物
            1.2. 仪器与试剂
                1.2.1. 实验仪器
                1.2.2. 实验材料
                1.2.3. 细胞
            1.3. 实验方法
                1.3.1. 腹水瘤细胞S180的培养
                1.3.2. 小鼠抗Eqtn多克隆抗体的制备与鉴定
                1.3.3. 自制多克隆抗体的蛋白特异性检测
                1.3.4. 自制多克隆抗体效价测定
        2. 结果
            2.1. 小鼠抗GST-Eqtn腹水多克隆抗体的鉴定
            2.2. 小鼠抗GST-Eqtn腹水多克隆抗体的效价测定
        3. 讨论
    第四章 对绵羊睾丸组织及绵羊精子中Eqtn蛋白的定位检测
        前言
        1. 材料与方法
            1.1. 实验动物
            1.2. 仪器与试剂
                1.2.1. 实验仪器
                1.2.2. 实验材料
                1.2.3. 常用试剂配制
            1.3. 实验方法
                1.3.1. 绵羊睾丸组织石蜡切片的制作
                1.3.2. 免疫组织化学染色
                1.3.3. 顶体反应前后Eqtn在精子中的定位
        2. 结果
            2.1. Eqtn蛋白在绵羊精子中的定位
            2.2. Eqtn蛋白在睾丸组织中的定位
        3. 讨论
参考文献
致谢
读硕士期间参与的科研项目与发表的论文



本文编号：3357290