体外成熟液中添加PAF对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达的影响
发布时间：2021-08-24 20:15
旨在探讨体外成熟（IVM）液中添加血小板活化因子（PAF）对牦牛卵母细胞发育能力及基因表达影响。本试验将牦牛1 025个卵丘-卵母细胞复合体（COCs）分为4组,分别在含不同浓度PAF(0、10-8、10-7和10-6mol·L-1)的IVM液中成熟后,与奶牛精子体外受精（IVF）和体外培养（IVC）,比较分析各组卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率以及COCs和胚胎中抗凋亡（BCL-2）、促凋亡（BAX）、表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）、转录因子（OCT-4和NANOG）和c-fos等基因的表达量差异。结果表明,IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1组的卵母细胞成熟率（（92.16±0.19）%）、卵裂率（（77.20±0.85）%）和囊胚率（（46.71±0.68）%）显著高于其他组（P<0.05）。qPCR结果显示,在该组成熟的COCs中BCL-2、EGF、EGFR、c-fos表达量显著上调（P<0.05）,而促凋亡基因BAX...
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(03)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
IVM液中PAF浓度对COCs中相关基因表达的影响
关于PAF改善早期胚胎质量方面的体内、体外研究结果基本一致,但对卵泡发育和受精以及早期胚胎发育能力方面的研究结果却不一致[13-17]。Fukuda和Breuel[15]研究发现,在小鼠排卵前4 d连续注射PAF对排卵率、受精率和卵裂率没有显著影响,但PAF可以显著提高扩张囊胚率。但是,Sakellariou等[20]研究则证明,在小鼠排卵前适当时间注射适量的PAF可以显著提高排卵率、受精率和扩张囊胚率。本试验比较研究了在IVM液中添加不同浓度PAF对牦牛卵母细胞体外成熟率以及用普通牛精子IVF后卵裂率和囊胚率的影响,结果发现,当IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1时,牦牛卵母细胞成熟率、IVF后的卵裂率和囊胚率均显著高于PAF高浓度组(10-6mol·L-1)和低浓度组(0、10-8mol·L-1)(P<0.05),即IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1是牦牛体外受精的最佳浓度。Kordan和Strze z ˙ ek [35] 试验证明,外源性PAF在1×10-8～1×10-6mol·L-1浓度时,可显著增加新鲜和冷冻保存猪精子的运动能力,以1×10-7mol·L-1浓度为最佳,而高浓度的PAF则可破坏精子的原生质膜,从而对精子产生损伤作用。因此,IVM液中高浓度PAF对牦牛卵母细胞的成熟和胚胎发育不利可能也与PAF对细胞膜的损伤作用有关。Sakellariou等[20]研究证明,小鼠注射单位体重的PAF过高对卵母细胞排卵率、卵裂率、桑囊胚率和扩张囊胚率都有不良影响,主要原因是在活体动物中高浓度的PAF导致LH水平升高,从而导致卵母细胞黄体化,影响卵母细胞质量、发育和附植能力。Ryan等[36]发现,在小鼠胚胎培养液中添加1.86 ×10-7或1.86×10-6mol·L-1 PAF时对2-细胞胚胎的囊胚发育率和体外培养48或72 h扩张囊胚率没有显著影响,但是,高浓度的PAF(9.3×10-6和18.6×10-6mol·L-1)对胚胎发育起有害作用。Lee等[19]发现,虽然在IVC液中添加PAF不能提高猪IVF胚胎发育率,但能显著提高猪体细胞核移植(SCNT)胚胎的囊胚率。O’Neill[16]发现,在胚胎培养液中添加PAF能显著提高小鼠的卵裂率和囊胚率。这些研究结果的不一致可能与胚胎种类(体内受精、IVF、SCNT)和培养系统(单位体积培养液中胚胎数量)的差异有关。在胚胎培养过程中,胚胎自分泌PAF和IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、EGF等生长因子进入培养液,促进胚胎发育[13,16],而胚胎培养液中这些生长因子的浓度与胚胎种类和培养液中胚胎浓度有关[16]。虽然本研究未测定COCs和胚胎自分泌的PAF浓度,但是单位体积IVM液中COCs的数量(每1 000 μL 30枚)和IVC液中胚胎数量(每40 μL 30枚)符合牦牛和普通牛体外受精基本规程要求[3-9],因此,筛选出的最佳PAF浓度对牦牛体外受精具有重要指导意义。PAF对卵泡发育和胚胎发育的作用主要通过卵泡颗粒细胞和胚胎细胞上的PAF受体(PAFr)介导实现[19,37]。但是目前,PAF与PAFr结合后对基因表达影响的机制还不清楚,因此,本研究对IVM液中PAF对COCs和胚胎中与细胞凋亡和增殖相关的一些重要基因表达调控进行了研究。在细胞凋亡过程中,抗凋亡因子BCL-2和促凋亡因子BAX为细胞提供信号通路,细胞内两种力量的差异决定细胞凋亡与发育命运[23-25]。本研究发现,IVM液中PAF浓度对牦牛卵母细胞IVM过程中BCL-2和BAX的表达有一定影响,IVM中PAF浓度为10-6mol·L-1时促凋亡基因BAX表达量显著高于其他组,而10-7mol·L-1组抗凋亡基因BCL-2表达量最高,显著高于10-6mol·L-1组(P<0.05, 图1)。说明IVM液中PAF浓度过高会促进卵母细胞凋亡,而浓度为10-7mol·L-1抗凋亡作用较强,有利于牦牛卵母细胞成熟。表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)、c-fos因子等能促进细胞的增殖和分化[8,16,26,29]。10-7mol·L-1组COCs中这些基因的表达水平最高,显著高于10-6mol·L-1组(P<0.05),说明适当浓度的PAF可以通过促进细胞的增殖和分化,从而促进牦牛卵母细胞的体外成熟。有研究表明,IVM液中适宜浓度的FSH也是通过提高牦牛卵母细胞EGF、EGFR和BCL-2的表达及降低BAX的表达来提高牦牛卵母细胞的发育能力[38]。OCT-4和NANOG主要维持胚胎细胞的多能性[27-28]。与赵天等[39]的研究结果一致,OCT-4在牦牛COCs和早期胚胎发育过程中的各个时期均有表达,且不同时期该基因的表达量存在差异,说明OCT-4可能参与胚胎合子型基因转录激活的调控过程和维持囊胚内细胞团全能性的过程。
【参考文献】：
期刊论文
[1]犏牛高效生产新模式的建立[J]. 熊显荣,李键,字向东,兰道亮,何世明,吴锦波,余忠华,王二耀. 中国兽医学报. 2019(05)
[2]FSH对牦牛卵母细胞EGF、EGFR表达及其细胞凋亡的影响[J]. 何翃闳,潘阳阳,张慧珠,李秦,王萌,崔燕,樊江峰,余四九. 畜牧兽医学报. 2018(09)
[3]基于高通量测序的犏牛囊胚玻璃化冷冻损伤机制研究[J]. 郑杰,蒲思颖,杨远潇,王琴,杨绕芬,字向东. 畜牧兽医学报. 2017(10)
[4]Oct 4在牦牛卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达[J]. 赵天,李谷月,潘阳阳,李月琴,陈平,温泽星,崔燕,余四九. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[5]体外受精生产犏牛胚胎与移植试验研究[J]. 孙永刚,徐惊涛,才让东智,马志杰. 畜牧兽医学报. 2013(05)
博士论文
[1]猪早期胚胎发育中体外培养体系优化及OCT4、NANOG功能研究[D]. 郭诗萌.东北农业大学 2019
本文编号：3360653
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(03)北大核心CSCD
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
IVM液中PAF浓度对COCs中相关基因表达的影响
关于PAF改善早期胚胎质量方面的体内、体外研究结果基本一致,但对卵泡发育和受精以及早期胚胎发育能力方面的研究结果却不一致[13-17]。Fukuda和Breuel[15]研究发现,在小鼠排卵前4 d连续注射PAF对排卵率、受精率和卵裂率没有显著影响,但PAF可以显著提高扩张囊胚率。但是,Sakellariou等[20]研究则证明,在小鼠排卵前适当时间注射适量的PAF可以显著提高排卵率、受精率和扩张囊胚率。本试验比较研究了在IVM液中添加不同浓度PAF对牦牛卵母细胞体外成熟率以及用普通牛精子IVF后卵裂率和囊胚率的影响,结果发现,当IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1时,牦牛卵母细胞成熟率、IVF后的卵裂率和囊胚率均显著高于PAF高浓度组(10-6mol·L-1)和低浓度组(0、10-8mol·L-1)(P<0.05),即IVM液中PAF浓度为10-7mol·L-1是牦牛体外受精的最佳浓度。Kordan和Strze z ˙ ek [35] 试验证明,外源性PAF在1×10-8～1×10-6mol·L-1浓度时,可显著增加新鲜和冷冻保存猪精子的运动能力,以1×10-7mol·L-1浓度为最佳,而高浓度的PAF则可破坏精子的原生质膜,从而对精子产生损伤作用。因此,IVM液中高浓度PAF对牦牛卵母细胞的成熟和胚胎发育不利可能也与PAF对细胞膜的损伤作用有关。Sakellariou等[20]研究证明,小鼠注射单位体重的PAF过高对卵母细胞排卵率、卵裂率、桑囊胚率和扩张囊胚率都有不良影响,主要原因是在活体动物中高浓度的PAF导致LH水平升高,从而导致卵母细胞黄体化,影响卵母细胞质量、发育和附植能力。Ryan等[36]发现,在小鼠胚胎培养液中添加1.86 ×10-7或1.86×10-6mol·L-1 PAF时对2-细胞胚胎的囊胚发育率和体外培养48或72 h扩张囊胚率没有显著影响,但是,高浓度的PAF(9.3×10-6和18.6×10-6mol·L-1)对胚胎发育起有害作用。Lee等[19]发现,虽然在IVC液中添加PAF不能提高猪IVF胚胎发育率,但能显著提高猪体细胞核移植(SCNT)胚胎的囊胚率。O’Neill[16]发现,在胚胎培养液中添加PAF能显著提高小鼠的卵裂率和囊胚率。这些研究结果的不一致可能与胚胎种类(体内受精、IVF、SCNT)和培养系统(单位体积培养液中胚胎数量)的差异有关。在胚胎培养过程中,胚胎自分泌PAF和IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、EGF等生长因子进入培养液,促进胚胎发育[13,16],而胚胎培养液中这些生长因子的浓度与胚胎种类和培养液中胚胎浓度有关[16]。虽然本研究未测定COCs和胚胎自分泌的PAF浓度,但是单位体积IVM液中COCs的数量(每1 000 μL 30枚)和IVC液中胚胎数量(每40 μL 30枚)符合牦牛和普通牛体外受精基本规程要求[3-9],因此,筛选出的最佳PAF浓度对牦牛体外受精具有重要指导意义。PAF对卵泡发育和胚胎发育的作用主要通过卵泡颗粒细胞和胚胎细胞上的PAF受体(PAFr)介导实现[19,37]。但是目前,PAF与PAFr结合后对基因表达影响的机制还不清楚,因此,本研究对IVM液中PAF对COCs和胚胎中与细胞凋亡和增殖相关的一些重要基因表达调控进行了研究。在细胞凋亡过程中,抗凋亡因子BCL-2和促凋亡因子BAX为细胞提供信号通路,细胞内两种力量的差异决定细胞凋亡与发育命运[23-25]。本研究发现,IVM液中PAF浓度对牦牛卵母细胞IVM过程中BCL-2和BAX的表达有一定影响,IVM中PAF浓度为10-6mol·L-1时促凋亡基因BAX表达量显著高于其他组,而10-7mol·L-1组抗凋亡基因BCL-2表达量最高,显著高于10-6mol·L-1组(P<0.05, 图1)。说明IVM液中PAF浓度过高会促进卵母细胞凋亡,而浓度为10-7mol·L-1抗凋亡作用较强,有利于牦牛卵母细胞成熟。表皮生长因子(EGF)及其受体(EGFR)、c-fos因子等能促进细胞的增殖和分化[8,16,26,29]。10-7mol·L-1组COCs中这些基因的表达水平最高,显著高于10-6mol·L-1组(P<0.05),说明适当浓度的PAF可以通过促进细胞的增殖和分化,从而促进牦牛卵母细胞的体外成熟。有研究表明,IVM液中适宜浓度的FSH也是通过提高牦牛卵母细胞EGF、EGFR和BCL-2的表达及降低BAX的表达来提高牦牛卵母细胞的发育能力[38]。OCT-4和NANOG主要维持胚胎细胞的多能性[27-28]。与赵天等[39]的研究结果一致,OCT-4在牦牛COCs和早期胚胎发育过程中的各个时期均有表达,且不同时期该基因的表达量存在差异,说明OCT-4可能参与胚胎合子型基因转录激活的调控过程和维持囊胚内细胞团全能性的过程。
【参考文献】：
期刊论文
[1]犏牛高效生产新模式的建立[J]. 熊显荣,李键,字向东,兰道亮,何世明,吴锦波,余忠华,王二耀. 中国兽医学报. 2019(05)
[2]FSH对牦牛卵母细胞EGF、EGFR表达及其细胞凋亡的影响[J]. 何翃闳,潘阳阳,张慧珠,李秦,王萌,崔燕,樊江峰,余四九. 畜牧兽医学报. 2018(09)
[3]基于高通量测序的犏牛囊胚玻璃化冷冻损伤机制研究[J]. 郑杰,蒲思颖,杨远潇,王琴,杨绕芬,字向东. 畜牧兽医学报. 2017(10)
[4]Oct 4在牦牛卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达[J]. 赵天,李谷月,潘阳阳,李月琴,陈平,温泽星,崔燕,余四九. 畜牧兽医学报. 2017(03)
[5]体外受精生产犏牛胚胎与移植试验研究[J]. 孙永刚,徐惊涛,才让东智,马志杰. 畜牧兽医学报. 2013(05)
博士论文
[1]猪早期胚胎发育中体外培养体系优化及OCT4、NANOG功能研究[D]. 郭诗萌.东北农业大学 2019
本文编号：3360653
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