利用CRISPR/Cas9技术一步生产FGF5基因敲除绵羊的研究
发布时间：2021-08-28 01:18
羊毛是全球经济中重要的农产品。在绵羊育种中羊毛长度是最有价值的性状之一。研究发现FGF5（Fibroblast Growth Factor 5）是毛囊周期性生长的抑制因子,当小鼠的FGF5基因缺失时其被毛长度显著增加。产生这种现象的原因是FGF5基因的沉默可以延长毛发生长周期中的生长期,进而产生毛发长度增加的表型。近几年,CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR Associated 9）作为一种新型的基因组编辑技术被广为应用,它在原核胚时期即可对动物模型和家畜进行有效的遗传编辑。本研究通过原核注射Cas9 mRNA和sgRNA（Single Guide RNA）的方法,成功利用CRISPR/Cas9技术生产出FGF5基因敲除绵羊。本研究首先根据绵羊的密码子偏嗜性对酿脓链球菌SF370的Cas9基因序列进行密码子优化,提高其在绵羊体内的表达效率。在绵羊基因组中共筛选设计了 3个靶向FGF5基因的sgRNAs。将优化后的绵羊Cas9及sgRNAs序列亚克隆构建真核表达载体U6-C...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
993年一0”年中国原毛进出口贸易皿(FAO
１丄２巧指核酸酶??巧指核酸酶（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮ）是一种人工改造的核酸内切酶，它由持异性的ＤＮＡ??结合结构域和非特异性的切割域两部分构成，是一个异源二聚体，其结构如图１－２所示。??ＤＮＡ结合结构域是由两个半化氨酸、两个组氨酸和一个巧离子共辆形成的单巧指模块Ｉ每个巧??指模块识别３－４个碱基的序列，将运些模块混搭，就能够靴向到我们期望的位置早期研究??中多采用左右两边各３个碎指蛋白识别总共１８ｂｐ的序列，也有构建方法通泣增加巧指蛋白数目??到左右两边各６个，从而增强识别的特异性１＂１。巧指核酸酶的切割域主要是指核酸内切酶机Ｗ，??单个仍Ｗ不能产生切割活性ｉｎ’?Ｗ。只有当两个识别位点的间距为６－８?ｂｐ时，两个仍別单体才??能相互作用形成二聚体行使酶切功能，从而实现基因修饰的目的ＰＷ。??到目前为止，ＺＦＮ已经成功应用于果蛹口１，线虫ｔｎｉ，斑马鱼口１，大鼠ｔＭＩ、拟南芥Ｐ５’２６１，??烟草Ｐ７’２８１，大豆ｐｓｉ，玉米ＰＷ等模式动植物：同时也应用于哺乳动物细胞模型Ｐ１１和小鼠的血友病??模型ｉｎｉ；还应用于家蚕ＰＳＩ、猪牛Ｐ９呼日兔子等经济动物。??巧指核酸酶技术使得基因组编辑效率得到大大提高
１丄２巧指核酸酶??巧指核酸酶（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮ）是一种人工改造的核酸内切酶，它由持异性的ＤＮＡ??结合结构域和非特异性的切割域两部分构成，是一个异源二聚体，其结构如图１－２所示。??ＤＮＡ结合结构域是由两个半化氨酸、两个组氨酸和一个巧离子共辆形成的单巧指模块Ｉ每个巧??指模块识别３－４个碱基的序列，将运些模块混搭，就能够靴向到我们期望的位置早期研究??中多采用左右两边各３个碎指蛋白识别总共１８ｂｐ的序列，也有构建方法通泣增加巧指蛋白数目??到左右两边各６个，从而增强识别的特异性１＂１。巧指核酸酶的切割域主要是指核酸内切酶机Ｗ，??单个仍Ｗ不能产生切割活性ｉｎ’?Ｗ。只有当两个识别位点的间距为６－８?ｂｐ时，两个仍別单体才??能相互作用形成二聚体行使酶切功能，从而实现基因修饰的目的ＰＷ。??到目前为止，ＺＦＮ已经成功应用于果蛹口１，线虫ｔｎｉ，斑马鱼口１，大鼠ｔＭＩ、拟南芥Ｐ５’２６１，??烟草Ｐ７’２８１，大豆ｐｓｉ，玉米ＰＷ等模式动植物：同时也应用于哺乳动物细胞模型Ｐ１１和小鼠的血友病??模型ｉｎｉ；还应用于家蚕ＰＳＩ、猪牛Ｐ９呼日兔子等经济动物。??巧指核酸酶技术使得基因组编辑效率得到大大提高
【参考文献】：
期刊论文
[1]Generation of a monkey with MECP2 mutations by TALEN-based gene targeting[J]. Zhen Liu,Xue Zhou,Ying Zhu,Zhi-Fang Chen,Bin Yu,Yan Wang,Chen-Chen Zhang,Yan-Hong Nie,Xiao Sang,Yi-Jun Cai,Yue-Fang Zhang,Chen Zhang,Wen-Hao Zhou,Qiang Sun,Zilong Qiu. Neuroscience Bulletin. 2014(03)
[2]Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J]. BAO Lei,CHEN HaiDe,JONG UiMyong,RIM CholHo,LI WenLing,LIN XiJuan,ZHANG Dan,LUO Qiong,CUI Chun,HUANG HeFeng,ZHANG Yan,XIAO Lei,FU ZhiXin. Science China（Life Sciences）. 2014(02)
本文编号：3367489
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
993年一0”年中国原毛进出口贸易皿(FAO
１丄２巧指核酸酶??巧指核酸酶（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮ）是一种人工改造的核酸内切酶，它由持异性的ＤＮＡ??结合结构域和非特异性的切割域两部分构成，是一个异源二聚体，其结构如图１－２所示。??ＤＮＡ结合结构域是由两个半化氨酸、两个组氨酸和一个巧离子共辆形成的单巧指模块Ｉ每个巧??指模块识别３－４个碱基的序列，将运些模块混搭，就能够靴向到我们期望的位置早期研究??中多采用左右两边各３个碎指蛋白识别总共１８ｂｐ的序列，也有构建方法通泣增加巧指蛋白数目??到左右两边各６个，从而增强识别的特异性１＂１。巧指核酸酶的切割域主要是指核酸内切酶机Ｗ，??单个仍Ｗ不能产生切割活性ｉｎ’?Ｗ。只有当两个识别位点的间距为６－８?ｂｐ时，两个仍別单体才??能相互作用形成二聚体行使酶切功能，从而实现基因修饰的目的ＰＷ。??到目前为止，ＺＦＮ已经成功应用于果蛹口１，线虫ｔｎｉ，斑马鱼口１，大鼠ｔＭＩ、拟南芥Ｐ５’２６１，??烟草Ｐ７’２８１，大豆ｐｓｉ，玉米ＰＷ等模式动植物：同时也应用于哺乳动物细胞模型Ｐ１１和小鼠的血友病??模型ｉｎｉ；还应用于家蚕ＰＳＩ、猪牛Ｐ９呼日兔子等经济动物。??巧指核酸酶技术使得基因组编辑效率得到大大提高
１丄２巧指核酸酶??巧指核酸酶（ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＺＦＮ）是一种人工改造的核酸内切酶，它由持异性的ＤＮＡ??结合结构域和非特异性的切割域两部分构成，是一个异源二聚体，其结构如图１－２所示。??ＤＮＡ结合结构域是由两个半化氨酸、两个组氨酸和一个巧离子共辆形成的单巧指模块Ｉ每个巧??指模块识别３－４个碱基的序列，将运些模块混搭，就能够靴向到我们期望的位置早期研究??中多采用左右两边各３个碎指蛋白识别总共１８ｂｐ的序列，也有构建方法通泣增加巧指蛋白数目??到左右两边各６个，从而增强识别的特异性１＂１。巧指核酸酶的切割域主要是指核酸内切酶机Ｗ，??单个仍Ｗ不能产生切割活性ｉｎ’?Ｗ。只有当两个识别位点的间距为６－８?ｂｐ时，两个仍別单体才??能相互作用形成二聚体行使酶切功能，从而实现基因修饰的目的ＰＷ。??到目前为止，ＺＦＮ已经成功应用于果蛹口１，线虫ｔｎｉ，斑马鱼口１，大鼠ｔＭＩ、拟南芥Ｐ５’２６１，??烟草Ｐ７’２８１，大豆ｐｓｉ，玉米ＰＷ等模式动植物：同时也应用于哺乳动物细胞模型Ｐ１１和小鼠的血友病??模型ｉｎｉ；还应用于家蚕ＰＳＩ、猪牛Ｐ９呼日兔子等经济动物。??巧指核酸酶技术使得基因组编辑效率得到大大提高
【参考文献】：
期刊论文
[1]Generation of a monkey with MECP2 mutations by TALEN-based gene targeting[J]. Zhen Liu,Xue Zhou,Ying Zhu,Zhi-Fang Chen,Bin Yu,Yan Wang,Chen-Chen Zhang,Yan-Hong Nie,Xiao Sang,Yi-Jun Cai,Yue-Fang Zhang,Chen Zhang,Wen-Hao Zhou,Qiang Sun,Zilong Qiu. Neuroscience Bulletin. 2014(03)
[2]Generation of GGTA1 biallelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and somatic cell nuclear transfer[J]. BAO Lei,CHEN HaiDe,JONG UiMyong,RIM CholHo,LI WenLing,LIN XiJuan,ZHANG Dan,LUO Qiong,CUI Chun,HUANG HeFeng,ZHANG Yan,XIAO Lei,FU ZhiXin. Science China（Life Sciences）. 2014(02)
本文编号：3367489
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