水牛miR-16b过表达腺病毒载体构建及生物信息学分析
发布时间：2021-08-29 04:58
试验旨在对水牛pri-miR-16b基因进行克隆并构建腺病毒表达载体,且对水牛miR-16b及其预测靶基因进行生物信息学分析,为研究其在水牛卵母细胞成熟过程中的作用奠定基础。利用RT-PCR技术从水牛卵巢基因组中扩增pri-miR-16b基因,采用同源重组的方法构建pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b质粒;利用BLAST程序进行同源性分析,Mega 7.0构建系统进化树,ViennaRNA Web Services预测pre-miR-16b的二级结构。对腺病毒质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre进行包装,经过3次扩增获得含有pri-miR-16b的腺病毒颗粒,将获得的病毒颗粒命名为Ad-miR-16b,并进行病毒滴度测定;利用Ad-miR-16b感染水牛卵丘细胞,实时荧光定量PCR检测miR-16b在卵丘细胞中的表达情况。利用TargetScan对miR-16b进行靶基因预测,对预测的靶基因进行KEGG通路富集。结果显示,试验成功克隆水牛pri-miR-16b序列,通过比对发现与牛的序列相似性分别为100%,与其他物种同源性较高,和黄牛的亲缘关系最近...
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(08)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b腺病毒质粒
试验成功扩增出493 bp的pri-miR-16b序列,胶回收目的片段;pDC316-mCMV-EGFP质粒经Hind Ⅲ酶切处理,胶回收线性化质粒,用重组酶连接,酶切鉴定正确后(图2),送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果与牛pri-miR-16b序列基本一致。2.2 pre-miR-16b序列分析
将测序得到的水牛pre-miR-16b序列通过RNAfold获得pre-miR-16b的二级结构,发现其带有典型的单一茎环结构,且成熟序列位于茎环结构的5′臂上(图3)。通过NCBI BLAST将水牛pre-miR-16b与黄牛(登录号:NR_030891.1)、山羊(登录号:NR_129608.1)、家兔(登录号:NR_162460.1)、鸭嘴兽(登录号:NR_034777.1)、斑胸草雀(登录号:NR_049124.1)、非洲爪蟾(登录号:NR_049654.1)、蜥蜴(登录号:NR_129879.1)和灰短尾鼠(登录号:NR_127564.1)进行相似性分析。结果显示,相似性分别为100%、97.8%、92.1%、89.8%、80.8%、76.5%、87.9%和85.7%(图4)。利用Mega 7.0构建系统进化树,结果见图5。由图5可知,水牛和黄牛同属牛科,聚为一支,亲缘关系最近。图4 水牛与其他物种pre-miR-16b基因同源性比对
【参考文献】：
期刊论文
[1]腺病毒载体构建研究进展[J]. 刘玉玲,钟柏茂. 国际儿科学杂志. 2018 (03)
[2]水牛卵母细胞GV/MⅡ期对应卵丘细胞miRNA差异表达分析[J]. 沈朋雷,秦希玲,尹倩,郭振伟,邓凯,杜姗姗,尹娜,阮子芸,石德顺,陆凤花. 畜牧兽医学报. 2017(05)
[3]用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用[J]. 鲍春旸,李军锋,张慧娜,张红飞,孙世惠,于虹,周育森. 生物技术通讯. 2011(05)
本文编号：3369957
【文章来源】：中国畜牧兽医. 2020,47(08)北大核心
【文章页数】：10 页
【部分图文】：
pDC316-mCMV-EGFP-pri-miR-16b腺病毒质粒
试验成功扩增出493 bp的pri-miR-16b序列,胶回收目的片段;pDC316-mCMV-EGFP质粒经Hind Ⅲ酶切处理,胶回收线性化质粒,用重组酶连接,酶切鉴定正确后(图2),送生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果与牛pri-miR-16b序列基本一致。2.2 pre-miR-16b序列分析
将测序得到的水牛pre-miR-16b序列通过RNAfold获得pre-miR-16b的二级结构,发现其带有典型的单一茎环结构,且成熟序列位于茎环结构的5′臂上(图3)。通过NCBI BLAST将水牛pre-miR-16b与黄牛(登录号:NR_030891.1)、山羊(登录号:NR_129608.1)、家兔(登录号:NR_162460.1)、鸭嘴兽(登录号:NR_034777.1)、斑胸草雀(登录号:NR_049124.1)、非洲爪蟾(登录号:NR_049654.1)、蜥蜴(登录号:NR_129879.1)和灰短尾鼠(登录号:NR_127564.1)进行相似性分析。结果显示,相似性分别为100%、97.8%、92.1%、89.8%、80.8%、76.5%、87.9%和85.7%(图4)。利用Mega 7.0构建系统进化树,结果见图5。由图5可知,水牛和黄牛同属牛科,聚为一支,亲缘关系最近。图4 水牛与其他物种pre-miR-16b基因同源性比对
【参考文献】：
期刊论文
[1]腺病毒载体构建研究进展[J]. 刘玉玲,钟柏茂. 国际儿科学杂志. 2018 (03)
[2]水牛卵母细胞GV/MⅡ期对应卵丘细胞miRNA差异表达分析[J]. 沈朋雷,秦希玲,尹倩,郭振伟,邓凯,杜姗姗,尹娜,阮子芸,石德顺,陆凤花. 畜牧兽医学报. 2017(05)
[3]用于鉴定microRNA靶基因的新型双萤光素酶报告基因系统的构建及应用[J]. 鲍春旸,李军锋,张慧娜,张红飞,孙世惠,于虹,周育森. 生物技术通讯. 2011(05)
本文编号：3369957
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