猪靶向PRRS病毒shRNA转基因克隆胚胎的体外生产与重编程发育

发布时间：2021-08-30 16:50

　　RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种强大的基因沉默技术,它的发现为了解病毒与宿主之间的相互作用提供了又一新视角,在抗病毒领域有着广泛的应用前景。猪繁殖与呼吸综合征（俗称蓝耳病,PRRS）是危害猪业生产的重大疫病之一,在全世界受到高度关注。研究表明,PRRS病毒（PRRSV）复制过程中也存在RNAi现象,并成功构建特异性靶向PRRSV基因组的高效表达shRNA质粒和病毒载体,为猪繁殖与呼吸综合征防治提供了新的探索方向。哺乳动物胚胎生物技术的日益发展及其与现代分子生物学技术的结合,使得利用遗传修饰开展转基因抗病育种成为可能。转基因克隆技术是以转基因体细胞为核供体,通过核移植生产转基因胚胎或动物的一种先进技术手段。将RNAi和转基因克隆技术相结合制备转基因动物,已被用作人类疾病的动物模型及动物抗病育种研究；但迄今尚未见到具有抗猪蓝耳病特性的相关转基因动物生产的报道。转基因克隆技术本身依然存在效率低、外源基因表达不稳定等问题。已有的研究表明,体细胞重编程过程中,DNA甲基化、组蛋白乙酰化对克隆效率和转基因表达都有直接的影响。本研究将具有抗PRRSV特性的shRNA表达盒... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：137 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号及縮略语
前言
第一部分 文献综述
    第一章 体细胞核移植与转基因动物生产
        1 动物体细胞核移植
        1.1 体细胞核移植技术研究简史
            1.2 体细胞核移植程序
                1.2.1 受体细胞准备
                1.2.2 供核细胞的选择
                1.2.3 重构胚的构建
                1.2.4 重构胚激活
                1.2.5 克隆胚胎培养
            1.3 体细胞核移植重编程机理
                1.3.1 DNA甲基化
                1.3.2 组蛋白乙酰化
                1.3.3 基因印迹
                1.3.4 端粒问题
        2 转基因动物生产
            2.1 转基因动物的制作方法
                2.1.1 原核注射法
                2.1.2 病毒载体法
                2.1.3 精子载体法
                2.1.4 胚胎干细胞法
                2.1.5 体细胞核移植法
            2.2 转基因动物应用
                2.2.1 在生命科学研究领域的应用
                2.2.2 在医学研究领域的应用
                2.2.3 在畜牧改良上的应用
                2.2.4 动物抗病育种
                2.2.5 动物生物反应器
        3 影响转基因克隆动物生产的因素
            3.1 克隆程序
                3.1.1 受体卵母细胞质量
                3.1.2 供核细胞
            3.2 表观遗传修饰对外源基因表达的影响
        参考文献
    第二章 RNAi技术在动物抗病毒研究中的应用前景
        1 RNAi技术
        2 RNAi技术原理
        3 RNAi技术在动物抗病毒研究中的应用
        4 病毒逃逸RNAi
        5 基于RNAi技术的转基因动物生产
        6 RNAi的问题和展望
        参考文献
第二部分 试验研究
    第三章 靶向PRRSV的shRNA转基因表达载体构建及其功能验证
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 结果
            3.1 shRNA转基因表达载体构建结果
            3.2 shRNA转基因表达载体在Marc145细胞上抑制PRRSV复制试验
        4 讨论
        5 小结
        参考文献
    第四章 核供体细胞对猪转基因克隆胚胎体外生产的影响
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 结果
            3.1 猪成纤维细胞建系
            3.2 G418筛选
            3.3 阳性细胞克隆的PCR鉴定
            3.4 转基因核供体细胞对猪克隆胚胎发育的影响
        4 讨论
            4.1 猪成纤维细胞的分离培养
            4.2 转基因阳性细胞克隆的筛选、传代培养和保存
            4.3 不同转基因供核细胞对猪克隆胚发育的影响
        5 小结
        参考文献
    第五章 猪转基因克隆胚胎体外发育的研究
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 结果
            3.1 培养液对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响
            3.2 激活方法对猪转基因克隆胚胎体外发育的影响
            3.3 曲古抑菌素A对猪转基因克隆胚胎体外发育的影响
        4 讨论
            4.1 胚胎体外培养液
            4.2 重构胚激活
            4.3 曲古抑菌素A对猪转基因克隆胚胎体外发育的影响
        5 小结
        参考文献
    第六章 曲古抑菌素A影响猪转基因克隆胚胎发育的机理研究
        摘要
        1 材料
        2 方法
        3 结果
            3.1 曲古抑菌素A对猪转基因克隆胚胎组蛋白乙酰化水平的影响
            3.2 曲古抑菌素A对猪转基因克隆胚胎发育相关基因表达的影响
            3.3 曲古抑菌素A对猪转基因克隆胚胎外源基因表达的影响
        4 讨论
            4.1 猪转基因克隆胚胎表观遗传修饰状态与胚胎的发育
            4.2 猪转基因克隆胚胎发育相关基因表达与胚胎的发育
            4.3 猪转基因克隆胚胎表观遗传修饰状态与外源基因表达
        5 小结
        参考文献
全文结论
创新点
攻读博士学位期间论文发表情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]TSA促进转基因猪体细胞核移植胚胎发育和外源基因表达[J]. 孔庆然,朱江,黄波,郇延军,王峰,石永乾,刘仲凤,武美玲,刘忠华.  遗传. 2011(07)
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博士论文
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[2]抗猪瘟病毒转基因猪的构建及初步研究[D]. 王铁东.吉林大学 2009



本文编号：3373150