口蹄疫病毒A型AF/72株VLPs的构筑及其免疫效果研究
发布时间：2021-08-31 19:25
口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的一种高度接触性传染病,能够造成重大的经济损失和不良的政治影响。本研究以FMDV A型AF/72毒株为材料,利用昆虫杆状病毒表达系统,构筑FMDV A型的病毒样颗粒（virus-like particles,VLPs）,为FMD疫苗研究提供新策略。1、本研究完成了FMDV A型AF/72株衣壳蛋白P12A与蛋白酶3C基因的克隆,并将其连接到p MD19-T载体上进行测序。对衣壳蛋白P12A与蛋白酶3C基因进行序列分析,发现FMDV A型AF/72株的P1结构编码区全长为2211bp,编码737aa。编码的4种结构蛋白分别为VP4 255bp（85aa）、VP2 654bp（218aa）、VP3 663bp（221aa）和VP1 639bp（213aa）。2A基因全长48bp,编码16aa。3C基因全长639bp,编码213aa。2、本研究采用两种不同的策略来研究FMDV A型AF/72株VLPs的组装。一是通过限制性酶切...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 口蹄疫病毒
1.2 口蹄疫疫苗研究进展
1.2.1 弱毒疫苗
1.2.2 灭活疫苗
1.2.3 蛋白质疫苗与合成肽疫苗
1.2.4 DNA疫苗
1.3 FMDV VLPs的研究进展
1.3.1 天然FMDV衣壳蛋白的组装
1.3.2 嵌合VLPs在抗口蹄疫中的研究
1.3.3 FMDV自身VLPs在抗口蹄疫中的研究
1.3.4 影响FMDV VLPs产生的因素
1.4 总结与展望
第二章 FMDV AF72株衣壳蛋白P12A与蛋白酶 3C基因的克隆与分析
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 试验方法
2.2.1 FMDV AF/72株RNA的提取
2.2.2 初始引物的合成与克隆
2.2.3 特异性引物的设计合成与特异性目的基因的克隆
2.3 试验结果
2.3.1 P12A和 3C长片段基因的RT-PCR
2.3.2 P12A和 3C长片段基因的克隆与鉴定
2.3.3 特异性P12A与 3C基因的PCR扩增
2.3.4 P12A和 3C特异性片段的克隆及鉴定
2.4 P12A和 3C基因序列分析
2.5 讨论与小结
第三章 FMDV AF/72株VLPS的表达与组装研究
3.1 试验材料
3.1.1 材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 试验方法
3.2.1 重组转移载体PFASTBAC? HTB-P12A3C的构建
3.2.2 重组转移载体PFASTBAC? DUAL-P12A3C的构建
3.2.3 E.COLI DH10 BAC感受态细胞的制备
3.2.4 重组质粒转化至E.coli DH10 Bac感受态细胞
3.2.5 重组杆状病毒质粒的提取
3.2.6 重组杆状病毒质粒的PCR鉴定
3.2.7 Sf9细胞的复苏与培养
3.2.8 重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞
3.2.9 P1代毒株的扩增
3.2.10 P3代毒株的PCR鉴定
3.2.11 重组蛋白的间接免疫荧光检测
3.2.12 重组蛋白的Western-blot检测
3.2.13 蔗糖密度梯度离心纯化
3.2.14 电镜观察
3.3 试验结果
3.3.1 P12A基因的双酶切
3.3.2 重组杆粒pFastBac? HTB-P12A与pFastBac? Dual-P12A的构建及鉴定
3.3.3 3C 基因的双酶切
3.3.4 重组杆粒pFastBac? HTB-P12A3C与pFastBac? Dual-P12A3C的构建及鉴定
3.3.5 重组杆粒Bacmid-HTB-P12A3C与Bacmid-Dual-P12A3C的构建与鉴定
3.3.6 重组杆粒转染 Sf9 细胞及 PCR 鉴定
3.3.7 间接免疫荧光分析
3.3.8 Western-blot检测
3.3.9 目的蛋白的电镜观察
3.4 讨论与小结
第四章 FMDV AF/72株VLPs或中间体的免疫原性分析
4.1 试验材料
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂
4.2 试验方法
4.2.1 疫苗的制备
4.2.2 动物免疫
4.2.3 豚鼠采血
4.2.4 抗FMDV特异性抗体的检测
4.2.5 微量中和抗体检测
4.2.6 细胞因子的检测
4.2.7 动物保护试验
4.3 试验结果
4.3.1 抗口蹄疫病毒特异性血清抗体水平
4.3.2 微量中和抗体的检测
4.3.3 细胞因子的检测
4.3.4 动物保护试验
4.4 讨论与小结
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用SUMO表达系统高效表达猪O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3基因[J]. 宋妮,温永俊,王凤雪,武华. 中国畜牧兽医. 2013(09)
[2]登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定[J]. 付春云,方丹云,刘岩,喻治准,江汉宁,江丽芳,周俊梅. 热带医学杂志. 2011(06)
[3]人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析[J]. 谢明辉,李少伟,沈文通,李仲艺,庄玉娣,莫小兵,顾颖,吴婷,张军,夏宁邵. 生物工程学报. 2009(07)
[4]昆虫杆状病毒表达载体系统的研究及应用[J]. 刘永平,王方海,苏志坚,李广宏,庞义. 昆虫知识. 2006(01)
[5]转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建[J]. 孙晓光,宋长征,张更林. 中国生物工程杂志. 2005(08)
[6]原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果[J]. 王永山,陆承平,周宗安,薛家宾. 中国农业科学. 2004(11)
[7]按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达[J]. 李平川,张晓光,周玲,曾毅. 病毒学报. 2004(03)
[8]共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性[J]. 金宁一,张洪勇,尹革芬,郑敏,刘彤,江文正,李子健. 科学通报. 2004(06)
[9]酵母表达系统及其应用研究[J]. 吴丽娟,蒋建新,朱佩芳,王正国,康格非. 生命的化学. 2003(01)
[10]猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性[J]. 吕建强,陈焕春,赵俊龙,肖少波,王革非. 微生物学报. 2002(06)
硕士论文
[1]牛IL-2和IFN-γ对Asia1型口蹄疫病毒G-H环多肽免疫效果的影响[D]. 葛兰云.东北农业大学 2009
本文编号：3375476
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
1.1 口蹄疫病毒
1.2 口蹄疫疫苗研究进展
1.2.1 弱毒疫苗
1.2.2 灭活疫苗
1.2.3 蛋白质疫苗与合成肽疫苗
1.2.4 DNA疫苗
1.3 FMDV VLPs的研究进展
1.3.1 天然FMDV衣壳蛋白的组装
1.3.2 嵌合VLPs在抗口蹄疫中的研究
1.3.3 FMDV自身VLPs在抗口蹄疫中的研究
1.3.4 影响FMDV VLPs产生的因素
1.4 总结与展望
第二章 FMDV AF72株衣壳蛋白P12A与蛋白酶 3C基因的克隆与分析
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 试验方法
2.2.1 FMDV AF/72株RNA的提取
2.2.2 初始引物的合成与克隆
2.2.3 特异性引物的设计合成与特异性目的基因的克隆
2.3 试验结果
2.3.1 P12A和 3C长片段基因的RT-PCR
2.3.2 P12A和 3C长片段基因的克隆与鉴定
2.3.3 特异性P12A与 3C基因的PCR扩增
2.3.4 P12A和 3C特异性片段的克隆及鉴定
2.4 P12A和 3C基因序列分析
2.5 讨论与小结
第三章 FMDV AF/72株VLPS的表达与组装研究
3.1 试验材料
3.1.1 材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器
3.2 试验方法
3.2.1 重组转移载体PFASTBAC? HTB-P12A3C的构建
3.2.2 重组转移载体PFASTBAC? DUAL-P12A3C的构建
3.2.3 E.COLI DH10 BAC感受态细胞的制备
3.2.4 重组质粒转化至E.coli DH10 Bac感受态细胞
3.2.5 重组杆状病毒质粒的提取
3.2.6 重组杆状病毒质粒的PCR鉴定
3.2.7 Sf9细胞的复苏与培养
3.2.8 重组杆状病毒质粒转染Sf9细胞
3.2.9 P1代毒株的扩增
3.2.10 P3代毒株的PCR鉴定
3.2.11 重组蛋白的间接免疫荧光检测
3.2.12 重组蛋白的Western-blot检测
3.2.13 蔗糖密度梯度离心纯化
3.2.14 电镜观察
3.3 试验结果
3.3.1 P12A基因的双酶切
3.3.2 重组杆粒pFastBac? HTB-P12A与pFastBac? Dual-P12A的构建及鉴定
3.3.3 3C 基因的双酶切
3.3.4 重组杆粒pFastBac? HTB-P12A3C与pFastBac? Dual-P12A3C的构建及鉴定
3.3.5 重组杆粒Bacmid-HTB-P12A3C与Bacmid-Dual-P12A3C的构建与鉴定
3.3.6 重组杆粒转染 Sf9 细胞及 PCR 鉴定
3.3.7 间接免疫荧光分析
3.3.8 Western-blot检测
3.3.9 目的蛋白的电镜观察
3.4 讨论与小结
第四章 FMDV AF/72株VLPs或中间体的免疫原性分析
4.1 试验材料
4.1.1 材料
4.1.2 主要试剂
4.2 试验方法
4.2.1 疫苗的制备
4.2.2 动物免疫
4.2.3 豚鼠采血
4.2.4 抗FMDV特异性抗体的检测
4.2.5 微量中和抗体检测
4.2.6 细胞因子的检测
4.2.7 动物保护试验
4.3 试验结果
4.3.1 抗口蹄疫病毒特异性血清抗体水平
4.3.2 微量中和抗体的检测
4.3.3 细胞因子的检测
4.3.4 动物保护试验
4.4 讨论与小结
第五章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用SUMO表达系统高效表达猪O型口蹄疫病毒VP0、VP1、VP3基因[J]. 宋妮,温永俊,王凤雪,武华. 中国畜牧兽医. 2013(09)
[2]登革病毒3型病毒样颗粒在酵母体内的表达与鉴定[J]. 付春云,方丹云,刘岩,喻治准,江汉宁,江丽芳,周俊梅. 热带医学杂志. 2011(06)
[3]人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析[J]. 谢明辉,李少伟,沈文通,李仲艺,庄玉娣,莫小兵,顾颖,吴婷,张军,夏宁邵. 生物工程学报. 2009(07)
[4]昆虫杆状病毒表达载体系统的研究及应用[J]. 刘永平,王方海,苏志坚,李广宏,庞义. 昆虫知识. 2006(01)
[5]转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建[J]. 孙晓光,宋长征,张更林. 中国生物工程杂志. 2005(08)
[6]原核表达的兔出血症病毒衣壳蛋白对兔的免疫保护效果[J]. 王永山,陆承平,周宗安,薛家宾. 中国农业科学. 2004(11)
[7]按酵母基因优化的HPV6型L1蛋白在大肠杆菌中高效表达[J]. 李平川,张晓光,周玲,曾毅. 病毒学报. 2004(03)
[8]共表达口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性[J]. 金宁一,张洪勇,尹革芬,郑敏,刘彤,江文正,李子健. 科学通报. 2004(06)
[9]酵母表达系统及其应用研究[J]. 吴丽娟,蒋建新,朱佩芳,王正国,康格非. 生命的化学. 2003(01)
[10]猪细小病毒VP2蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性[J]. 吕建强,陈焕春,赵俊龙,肖少波,王革非. 微生物学报. 2002(06)
硕士论文
[1]牛IL-2和IFN-γ对Asia1型口蹄疫病毒G-H环多肽免疫效果的影响[D]. 葛兰云.东北农业大学 2009
本文编号：3375476
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3375476.html
