腺联病毒AAP5和禽腺联病毒VP3的原核表达及单克隆抗体制备

发布时间：2021-08-31 21:16

　　作为基因转移的载体,腺联病毒（adeno-associated virus, AAV）具有外源基因表达稳定、感染细胞类型多、无致病性、免疫原性低等优点,重组AAV载体在基因治疗研究中受到越来越多的重视。目前对于AAV基因组复制的研究较为详细,但病毒装配的研究很少。AAV基因组由分别编码非结构蛋白Rep和结构蛋白Cap的开放阅读框（ORF）组成,其中Cap基因有两个ORF, ORF1编码衣壳蛋白、VP1、VP2和VP3,VP3为病毒衣壳的主要成分,也是决定AAV血清型的主要蛋白质；ORF2编码病毒装配活性蛋白（AAP）。本研究主要为进一步研究AAV各亚型和VP3蛋白之间的关系提供有效的生物工具。本研究以含有5型AAV Cap基因的质粒（pAAV5-2）为模板,PCR扩增5型腺联病毒AAP编码序列（AAP5）；以pCRAAAV为模板,PCR扩增禽腺联病毒VP3编码序列（AVP3）,将扩增的目的片段分别插入原核表达载体pET-30a,进行原核表达。SDS-PAGE分析结果表明表达的AAP5蛋白为预期的44KD,主要存在于重组菌裂解物离心后的上清中；AVP3蛋白为预期的81KD,主要以包涵体形... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
目录
缩写中英文对照
综述 腺联病毒的研究进展
    1 腺联病毒的生物学特性
        1.1 理化特性
        1.2 基因组结构
        1.3 腺联病毒的复制周期
        1.4 腺联病毒的衣壳装配
        1.5 AAP蛋白和VP3蛋白的关系
    2 禽腺联病毒
    3 重组载体的应用
    参考文献
研究内容一
    1 材料
        1.1 载体、菌株、质粒
        1.2 主要生物学试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 培养液
        1.5 感受态的制备
        1.6 纯化蛋白的试剂的配制
    2 试验方法和步骤
        2.1 原核表达质粒的构建
        2.2 蛋白的诱导表达
        2.3 蛋白的纯化
    3 结果与分析
        3.1 表达质粒构建
        3.2 蛋白的诱导表达和纯化
    4 讨论
研究内容二
    1 材料
        1.1 细胞和实验动物
        1.2 主要生物学试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 细胞培养基的配制
    2 方法
        2.1 小鼠免疫
        2.2 真核表达载体构建
        2.3 细胞的准备
        2.4 转染
        2.5 间接免疫荧光
        2.7 方阵试验确定最佳包被抗原浓度及阳性血清效价的测定
        2.8 细胞融合
        2.9 阳性杂交瘤细胞的筛选
        2.10 亚克隆
        2.11 单克隆抗体的Westem-blot特异性检测
        2.12 腹水制备
        2.13 单克隆抗体ELISA效价测定
    3 结果
        3.1 小鼠免疫血清的抗体效价检测
        3.2 腹水单克隆抗体的效价测定
        3.3 腹水单克隆抗体的特异性测定
        3.4 免疫血清的特异性检测
    4 讨论
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]禽腺联病毒的分离及其基因组鉴定[J]. 王建业,孙怀昌,朱国强.  扬州大学学报. 2005(02)



本文编号：3375626