哺乳动物细胞悬浮培养扩增伪狂犬病病毒的工艺研究
发布时间：2021-09-02 02:01
伪狂犬病（PR）是一种对猪等哺乳动物具有重大经济影响的病毒性疾病,一旦爆发,将会对全世界养猪行业造成巨大的经济损失。目前,接种伪狂犬病疫苗是绝大多数发展中国家控制和预防PR最有效的方式之一。由于伪狂犬病病毒（PRV）具有泛嗜性,对多种哺乳动物细胞敏感,常将PRV接种BHK-21细胞、PK-15细胞及Vero细胞等进行扩增并生产PR灭活病毒疫苗。随着新型PRV变异株的出现导致中国猪群中PRV感染情况恶化以及畜牧业的飞速发展,PR灭活病毒疫苗的需求量剧增。而现阶段我国PR灭活病毒疫苗的生产工艺主要存在工艺不稳定及企业生产效率低下等问题,相对落后的滚瓶工艺以及反应器微载体悬浮工艺生产PR灭活病毒疫苗是导致目前企业生产效率低下的主要原因。因此,采用生物反应器无血清悬浮培养哺乳动物细胞高效扩增PRV是解决当前问题的关键。所以,建立稳定可行的无血清悬浮培养动物细胞高效扩增PRV的生产工艺,对于减轻PR在中国养猪行业造成的经济损失是非常有必要的。本文首先以自主开发的培养基以及自主悬浮驯化的对PRV较为敏感的BHK-21细胞、PK-15细胞及Vero细胞为研究对象,考察以上三种备选细胞在各自生长培养基...
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２伪狂犬病病毒的感染途径示意图??
为０．００５，接??毒时密度为３．０（＾１〇６（＾１１８／１１１１，摇瓶装液量为３〇１１１１，对以上三种备选细胞分别进行相同??操作条件下的ＰＲＶ接毒实验。分别在：ＰＲＶ感染后第２４?ｈ、４８?ｈ及７２?ｈ进行取样计数、??检测细胞活率，并留取２００?ｐｉ无菌样用于后续的ＰＲＶ滴度的测定。??３．３结果与讨论??３．３．１种毒适应??将ＰＲＶ病毒株首先在ＳＴ贴壁细胞中适应１代得到Ｐ０代种毒，之后在无血清悬浮??细胞ＢＨＫ－２１中进行传代适应得到Ｐ１－Ｐ４代种毒，ＰＲＶ传代适应结果如图３．１所示。??１〇?１??１０?ｔ???二９?＿?Ａ?□?Ｐ０?０Ｐ２?°Ｐ３?０Ｐ４?ｆ?９＿?Ｂ?ＱＰ〇?Ｅ３Ｐ１?ＢＰ２?０Ｐ３?ＳＰ４??ｉ：：?ｊ?ｊｉ?ｉｉ?ｉ＼：：?＿?ｉ?“??Ｈ１纖ｆｅ＿．＿?ｉｘ：ｌｉ?１?１?１?Ｍ??２４?Ｔｉｍｅ?ｐｏｓｔ?ｉｎａｃｔｉｏｎ?（ｈｏｕｒ）７２?Ｐ〇?Ｐ１?Ｐ２?Ｐ３?Ｐ４??图３．１传代适应过程中病毒滴度（Ａ）和每代种毒最大病毒滴度（Ｂ）??Ｆｉｇ．?３．１?Ｖｉｒｕｓ?ｔｉｔｅｒ?（Ａ）?ａｎｄ?ｍａｘｉｍｕｍ?ｖｉｒｕｓ?ｔｉｔｅｒ?ｆｏｒ?ｅａｃｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?（Ｂ）?ｉｎ?ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ??由图３．１可见，在连续的ＰＲＶ传代适应过程中，Ｐ０代种毒在接毒后第７２?ｈ达到最??大ＰＲＶ滴度，为８．００１ｇＴＣＩＤ５Ｑ／ｍｌ?（Ｐ０）。Ｐ１－Ｐ４代种毒是在悬浮细胞ＢＨＫ－２１中进行传??代适应后所得，不断传代适应过程中的Ｐ１－Ｐ４代种毒的ＰＲＶ滴度呈现出先上升后下降??的趋势，都在ＰＲＶ感染后第４８ｈ达到最大ＰＲＶ滴度。Ｐ１－Ｐ４代
性维持的基矗细胞是否适应培养基，是否在培养基中能够正常增殖，对??整个伪狂犬病病毒生产工艺起着至关重要的作用。为此需要考察ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５??细胞及Ｖｅｒｏ细胞在其相对应的培养基中的形态，长期连续稳定的传代和批培养生长情??况等。??３．３．２．１细胞形态??分别取传代培养过程中的ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５细胞及Ｖｅｒｏ细胞进行计数，观察三??种细胞的形态、直径与细胞活率。??義??１。謂、ｖ?Ｖ，Ｖ。。Ｋ??ＢＨＫ－２１细胞?ＰＫ－１５细胞?Ｖｅｒｏ细胞??图３．２?ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－丨５细胞及Ｖｅｒｏ细胞的生长形态??Ｆｉｇ．?３．２?Ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＢＨＫ－２１?ｃｅｌｌｓ，?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?Ｖｅｒｏ?ｃｅｌｌｓ??由图３．２可见，ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５细胞及Ｖｅｒｏ细胞在各自的无血清培养基中的??细胞状态良好，未见明显结团的现象、细胞形态圆润、亮而通透、大小均一且轮廓清晰。??ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５细胞及Ｖｅｒｏ细胞的平均直径分别为１５．５０叫１、１７．５０?ｕｒｎ、１５．８０叫，??三种细胞活率都在９９％以上，表明以上三种备选细胞在各自的培养基中都能很好的适??应。??３．３．２．２传代情况??将己经连续稳定传代了?３次以上的种子细胞稀释接种到该细胞所对应的无血清培养??基中，密度为１．００＞＜１０６￡６１１３／１１１１，培养体系为１２５〇１丨的小摇瓶，装液量为３０?１１１丨并放置??于转速为１３０ｒｐｍ的摇床上，恒温培养箱的参数设定为３７°Ｃ、５％Ｃ〇２。每间隔２４ｈ取??
本文编号：3378086
【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２伪狂犬病病毒的感染途径示意图??
为０．００５，接??毒时密度为３．０（＾１〇６（＾１１８／１１１１，摇瓶装液量为３〇１１１１，对以上三种备选细胞分别进行相同??操作条件下的ＰＲＶ接毒实验。分别在：ＰＲＶ感染后第２４?ｈ、４８?ｈ及７２?ｈ进行取样计数、??检测细胞活率，并留取２００?ｐｉ无菌样用于后续的ＰＲＶ滴度的测定。??３．３结果与讨论??３．３．１种毒适应??将ＰＲＶ病毒株首先在ＳＴ贴壁细胞中适应１代得到Ｐ０代种毒，之后在无血清悬浮??细胞ＢＨＫ－２１中进行传代适应得到Ｐ１－Ｐ４代种毒，ＰＲＶ传代适应结果如图３．１所示。??１〇?１??１０?ｔ???二９?＿?Ａ?□?Ｐ０?０Ｐ２?°Ｐ３?０Ｐ４?ｆ?９＿?Ｂ?ＱＰ〇?Ｅ３Ｐ１?ＢＰ２?０Ｐ３?ＳＰ４??ｉ：：?ｊ?ｊｉ?ｉｉ?ｉ＼：：?＿?ｉ?“??Ｈ１纖ｆｅ＿．＿?ｉｘ：ｌｉ?１?１?１?Ｍ??２４?Ｔｉｍｅ?ｐｏｓｔ?ｉｎａｃｔｉｏｎ?（ｈｏｕｒ）７２?Ｐ〇?Ｐ１?Ｐ２?Ｐ３?Ｐ４??图３．１传代适应过程中病毒滴度（Ａ）和每代种毒最大病毒滴度（Ｂ）??Ｆｉｇ．?３．１?Ｖｉｒｕｓ?ｔｉｔｅｒ?（Ａ）?ａｎｄ?ｍａｘｉｍｕｍ?ｖｉｒｕｓ?ｔｉｔｅｒ?ｆｏｒ?ｅａｃｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?（Ｂ）?ｉｎ?ｐａｓｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ??由图３．１可见，在连续的ＰＲＶ传代适应过程中，Ｐ０代种毒在接毒后第７２?ｈ达到最??大ＰＲＶ滴度，为８．００１ｇＴＣＩＤ５Ｑ／ｍｌ?（Ｐ０）。Ｐ１－Ｐ４代种毒是在悬浮细胞ＢＨＫ－２１中进行传??代适应后所得，不断传代适应过程中的Ｐ１－Ｐ４代种毒的ＰＲＶ滴度呈现出先上升后下降??的趋势，都在ＰＲＶ感染后第４８ｈ达到最大ＰＲＶ滴度。Ｐ１－Ｐ４代
性维持的基矗细胞是否适应培养基，是否在培养基中能够正常增殖，对??整个伪狂犬病病毒生产工艺起着至关重要的作用。为此需要考察ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５??细胞及Ｖｅｒｏ细胞在其相对应的培养基中的形态，长期连续稳定的传代和批培养生长情??况等。??３．３．２．１细胞形态??分别取传代培养过程中的ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５细胞及Ｖｅｒｏ细胞进行计数，观察三??种细胞的形态、直径与细胞活率。??義??１。謂、ｖ?Ｖ，Ｖ。。Ｋ??ＢＨＫ－２１细胞?ＰＫ－１５细胞?Ｖｅｒｏ细胞??图３．２?ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－丨５细胞及Ｖｅｒｏ细胞的生长形态??Ｆｉｇ．?３．２?Ｃｅｌｌ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ＢＨＫ－２１?ｃｅｌｌｓ，?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ａｎｄ?Ｖｅｒｏ?ｃｅｌｌｓ??由图３．２可见，ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５细胞及Ｖｅｒｏ细胞在各自的无血清培养基中的??细胞状态良好，未见明显结团的现象、细胞形态圆润、亮而通透、大小均一且轮廓清晰。??ＢＨＫ－２１细胞、ＰＫ－１５细胞及Ｖｅｒｏ细胞的平均直径分别为１５．５０叫１、１７．５０?ｕｒｎ、１５．８０叫，??三种细胞活率都在９９％以上，表明以上三种备选细胞在各自的培养基中都能很好的适??应。??３．３．２．２传代情况??将己经连续稳定传代了?３次以上的种子细胞稀释接种到该细胞所对应的无血清培养??基中，密度为１．００＞＜１０６￡６１１３／１１１１，培养体系为１２５〇１丨的小摇瓶，装液量为３０?１１１丨并放置??于转速为１３０ｒｐｍ的摇床上，恒温培养箱的参数设定为３７°Ｃ、５％Ｃ〇２。每间隔２４ｈ取??
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