猪O3FAR1基因启动子的克隆及转录调控分析

发布时间：2021-09-03 07:14

　　因为在遗传以及理化因素等方面与人存在很大的相似性,猪,这一主要家畜,常常作为模型被用于一些疾病的研究,比如说糖尿病和肥胖,脂代谢紊乱等。近年来,游离脂肪酸的生理功能受到广泛关注,因为其不仅可以为组织提供能量而且还可以作为信号分子介导各种细胞进程。有研究发现,糖尿病、肥胖、脂代谢紊乱与外周游离脂肪酸水平的升高存在着紧密的联系。03FAR1是新发现的的长链脂肪酸受体,体内的脂质生成、细胞增殖、激素分泌等代谢过程都存在着03FAR1的参与。03FAR1被认为与某些疾病有关,可以把它当作一些疾病的药物靶点,比如说肥胖症,糖尿病等。在基因表达调控机制中,基因的转录是一个非常主要的过程,它在遗传信息传递中起到着纽带的作用。而转录的频率和转录起始位点受到启动子这一关键的元件调控。启动子主要通过与转录因子相互作用,来调控基因的表达。启动子的识别,对于阐述基因的功能来说有着非常重要的作用。为了进一步了解猪03FAR1基因的功能和转录调控机制,我们克隆出猪03FAR1基因的启动子区域,并对其核心区域进行研究,研究结果如下：（1）利用荧光定量PCR技术检测了猪的O3FAR1基因在各个组织的表达情况,并绘制了... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：85 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
中英文缩写对照表
第一章 文献综述
    1 前言
    2 真核生物启动子研究概述
        2.1 真核启动子的结构
        2.2 转录因子与启动子
        2.3 启动子的研究热点
    3 游离脂肪酸的研究进展
        3.1 游离脂肪酸
        3.2 游离脂肪酸受体
    4 O3FAR1基因的研究概述
    5 本试验研究的目的与意义
第二章 材料与方法
    1 试验材料与试剂
        1.1 主要的生化试剂和药品
        1.2 细胞、菌株和载体及猪基因组DNA
        1.3 试剂盒
        1.4 主要的仪器及设备
        1.5 缓冲液和常用试剂的配制
        1.6 主要的生物学软件和网站
        1.7 所用载体
    2 试验方法与步骤
        2.1 猪不同组织总RNA的提取及cDNA的合成
        2.2 猪O3FAR1基因组织表达谱分析
        2.3 猪O3FAR1基因5'端上游调控区域的克隆和分析
            2.3.1 克隆基因5'端上游调控区域
            2.3.2 猪O3FAR1基因5'端上游调控区域的生物信息学分析
        2.4 猪O3FAR1基因5'端上游调控区域的缺失分析
            2.4.1 基因5端上游调控区域缺失载体的构建
            2.4.2 启动子在三种不同真核细胞中的活性分析
        2.5 猪O3FAR1基因核心启动子区的寻找及转录因子分析
        2.6 定点突变的验证试验
            2.6.1 构建野生型和突变型的荧光报告载体质粒
            2.6.2 野生型和突变型的荧光报告载体质粒的瞬时转染
            2.6.3 构建转录因子C/EBPβ
            2.6.4 野生型荧光报告载体质粒与转录因子的共转染
        2.7 转录因子的超表达与RNA干扰
            2.7.1 超表达与RNA干扰定量引物的设计
            2.7.2 转录因子的超表达
            2.7.3 转录因子的RNA干扰试验
        2.8 EMSA验证试验
            2.8.1 EMSA探针的设计
            2.8.2 核蛋白的抽提
            2.8.3 结合反应
            2.8.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
            2.8.5 电转移
            2.8.6 交联固定与化学发光反应
            2.8.7 化学发光图像显示
        2.9 猪O3FAR1基因的超表达试验
            2.9.1 猪O3FAR1基因CDS区的获取
            2.9.2 pcDNA3.1-CDS真核表达载体的构建
            2.9.3 pcDNA3.1-CDS真核表达载体的瞬时转染实验
            2.9.4 细胞RNA的提取与cDNA第一链的合成
            2.9.5 荧光定量PCR检测
第三章 结果分析
    1 猪O3FAR1基因启动子克隆与功能分析
        1.1 猪O3FAR1基因的组织表达谱分析
        1.2 猪O3FAR1基因启动子上游调控区域的克隆及分析
            1.2.1 猪O3FAR1基因5'上游调控序列的获取
            1.2.2 猪O3FAR1基因启动子的生物信息学分析
            1.2.3 猪O3FAR1基因5'上游调控序列的克隆
        1.3 猪O3FAR1启动子缺失载体的构建
            1.3.1 扩增缺失片段
            1.3.2 构建双荧光素酶报告基因载体
        1.4 猪O3FAR1启动子活性的检测
        1.5 点突变试验验证
        1.6 转录因子的超表达试验
        1.7 转录因子的RNA干扰试验
        1.8 EMSA试验验证结果
    2 猪O3FAR1基因的超表达试验
        2.1 不同物种O3FAR1基因的生物信息学比对
        2.2 猪O3FAR1基因超表达载体的构建
        2.3 超表达载体转染细胞后RNA的获取
        2.4 荧光定量PCR检测猪O3FAR1基因超表达结果
第四章 讨论
    1 猪O3FAR1基因的生物信息学与表达谱分析
        1.1 猪O3FAR1基因的生物信息学分析
        1.2 猪O3FAR1基因的表达谱分析
    2 启动子的活性分析
    3 转录因子CEBPβ与猪O3FAR1基因关系的讨论
        3.1 超表达结果
        3.2 RNA干扰结果
        3.3 转录因子CEBPβ与脂肪组织发育的关系
    4 本试验中一些试验技术的讨论
        4.1 关于siRNA干扰技术
        4.2 关于EMSA试验技术
第五章 小结
    1 本研究的主要成果
    2 本研究的不足之处及下一步计划
参考文献
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]PPARγ2启动子的克隆及甲基化与基因表达的相关性分析[J]. 曹雁行,张敏,冯鑫磊,李星星,潘庆杰.  生物技术. 2013(04)
[2]GPR120的研究进展[J]. 卢伊娜,胡慧,朱维良,王贺瑶.  生命科学. 2008(02)
[3]猪抗病育种候选基因研究进展[J]. 袁树楷,王金勇,谢和芳,李琴,白小青.  中国畜牧杂志. 2007(15)
[4]瘦肉猪育种的发展及展望[J]. 熊远著.  中国工程科学. 2000(09)



本文编号：3380667