喹烯酮致HepG2细胞毒性与凋亡的分子调控机理研究

发布时间：2021-09-03 22:45

　　喹烯酮（Quinocetone）属喹噁啉-1,4-二氧化物,是我国首创的一类新兽药,具有抗菌、止泻和促生长作用,目前己广泛应用于养猪业中。同类药物中的卡巴氧和喹乙醇由于具有遗传毒性和潜在的致癌作用,己被世界上许多国家禁止或限用做动物饲料添加剂。具有相同母核结构的喹烯酮体内外实验均显示出一定的遗传毒性,但其毒性作用机理仍不清楚。本研究以体外培养的具有代谢酶活性的人肝癌HepG2细胞为模型,研究喹烯酮的细胞毒性作用及其产生机制,分析喹烯酮对HepG2细胞全基因组表达谱的影响,探讨喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡的分子调控机理,为评估喹烯酮对食品动物和人的安全性提供理论依据。MTT试验结果表明喹烯酮能抑制HepG2细胞的增殖,24h和48h的IC50值分别为9.2μg/ml和6.7μg/ml。LDH释放试验显示喹烯酮能促使HepG2释放乳酸脱氢酶。流式细胞术检测发现喹烯酮对HepG2细胞具有显著的周期阻滞作用,低浓度喹烯酮使细胞阻滞于S期,高浓度时阻滞于Go/G1期。普通光学显微镜观察、Hoechst33342/PI染色观察及Annexin V-FITC/PI双染法流式检测结果表明喹烯酮能够诱导... 

【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：154 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
图表目录
缩略词表
第一章 绪论
    1.1 喹烯酮
        1.1.1 基本概况
        1.1.2 毒性作用
    1.2 细胞凋亡
        1.2.1 细胞凋亡概述
        1.2.2 细胞凋亡的分子信号通路
        1.2.3 细胞凋亡的调控机制
    1.3 研究目的和意义
第二章 喹烯酮致HepG2细胞的细胞毒性作用
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 药物
        2.2.2 细胞株
        2.2.3 试剂盒
        2.2.4 主要试剂
        2.2.5 主要仪器
    2.3 方法
        2.3.1 溶液配制
        2.3.2 细胞培养
        2.3.3 细胞存活率测定(MTT法)
        2.3.4 乳酸脱氢酶法细胞毒性检测(LDH释放检测试验)
        2.3.5 细胞周期分布检测
        2.3.6 细胞凋亡的形态学观察
        2.3.7 Annexin V-FITC/PI双染法定量检测细胞凋亡
        2.3.8 细胞自噬的形态学观察
        2.3.9 细胞自噬的流式细胞仪检测
        2.3.10 数据分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 喹烯酮抑制HepG2细胞的生长
        2.4.2 喹烯酮对HepG2细胞膜完整性的影响
        2.4.3 喹烯酮对HepG2细胞周期分布的影响
        2.4.4 喹烯酮诱导HepG2细胞发生凋亡
        2.4.5 喹烯酮诱导HepG2细胞发生自噬
    2.5 讨论
        2.5.1 HepG2细胞模型
        2.5.2 喹烯酮的细胞毒性作用
        2.5.3 喹烯酮诱导细胞周期阻滞
        2.5.4 喹烯酮诱导细胞凋亡
        2.5.5 喹烯酮诱导细胞自噬
    2.6 小结
第三章 喹烯酮致HepG2细胞毒性作用机制初探
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 药物
        3.2.2 细胞株
        3.2.3 抗体
        3.2.4 试剂盒
        3.2.5 主要试剂
        3.2.6 主要仪器
    3.3 方法
        3.3.1 溶液配制
        3.3.2 细胞内ROS水平的测定
        3.3.3 8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量测定
        3.3.4 细胞存活率检测
        3.3.5 细胞凋亡检测
        3.3.6 线粒体膜电位(△ψ_m)检测
        3.3.7 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达
        3.3.8 数据分析
    3.4 结果与分析
        3.4.1 喹烯酮对HepG2细胞内ROS水平的影响
        3.4.2 喹烯酮对细胞内8-OHdG含量的影响
        3.4.3 NAC对细胞存活率的影响
        3.4.4 NAC对细胞凋亡的影响
        3.4.5 NAC对线粒体膜电位改变的影响
        3.4.6 NAC对凋亡相关蛋白表达的影响
    3.5 讨论
        3.5.1 氧化应激反应与氧化性DNA损伤
        3.5.2 抗氧化剂对ROS生成和细胞存活率的作用
        3.5.3 抗氧化剂对细胞凋亡的作用
    3.6 小结
第四章 喹烯酮致HepG2细胞全基因组表达谱的改变
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 药物
        4.2.2 细胞株
        4.2.3 试剂盒
        4.2.4 表达谱基因芯片
        4.2.5 主要试剂
        4.2.6 主要仪器
    4.3 方法
        4.3.1 溶液配制
        4.3.2 细胞染毒
        4.3.3 芯片检测样品的制备
        4.3.4 表达谱芯片的检测
        4.3.5 芯片的数据处理与分析
    4.4 结果与分析
        4.4.1 RNA样品纯度和质量鉴定结果
        4.4.2 芯片扫描图像结果
        4.4.3 芯片检测质控结果
        4.4.4 芯片数据的视图分析结果
        4.4.5 芯片数据的统计分析结果
        4.4.6 生物信息学分析结果
    4.5 讨论
        4.5.1 基因芯片检测技术
        4.5.2 喹烯酮诱导HepG2细胞全基因表达谱的改变
        4.5.3 细胞凋亡相关差异基因的分析
    4.6 小结
第五章 喹烯酮致细胞凋亡分子调节机理的研究
    5.1 引言
    5.2 材料
        5.2.1 药物
        5.2.2 细胞株
        5.2.3 抗体
        5.2.4 试剂盒
        5.2.5 主要试剂
        5.2.6 主要仪器
    5.3 方法
        5.3.1 溶液配制
        5.3.2 TUNEL实验
        5.3.3 线粒体膜电位的测定
        5.3.4 胞浆蛋白的提取
        5.3.5 Caspase酶活性检测
        5.3.6 Annexin V-FITC/PI双染法定量检测细胞凋亡
        5.3.7 Real-time qPCR检测凋亡相关基因
        5.3.8 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达
        5.3.9 数据分析
    5.4 结果与分析
        5.4.1 TUNEL法流式检测结果
        5.4.2 线粒体膜电位的变化
        5.4.3 细胞色素C的释放
        5.4.4 Caspase酶活性的变化
        5.4.5 Caspase抑制剂对细胞凋亡的影响
        5.4.6 TNFR1和TNF-α蛋白表达的变化
        5.4.7 TNFR1受体阻断剂对凋亡的影响
        5.4.8 凋亡相关基因mRNA表达的变化
        5.4.9 凋亡相关蛋白表达的变化
    5.5 讨论
        5.5.1 喹烯酮诱导细胞凋亡的DNA变化
        5.5.2 喹烯酮诱导HepG2细胞凋亡的分子信号通路
        5.5.3 p38 MAPK和JNK信号对喹烯酮所致凋亡的调节作用
    5.6 小结
第六章 结论及研究展望
    6.1 结论
    6.2 研究展望
第七章 创新点
参考文献
致谢
个人简介



本文编号：3382013