猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用
发布时间：2021-09-04 09:40
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的一种急性肠道传染病,主要导致感染猪的腹泻、呕吐及脱水症状,对哺乳仔猪有很高的致死率,给世界养猪业造成巨大的经济损失。实验室现有的比较常用的PEDV诊断方法有免疫荧光、ELISA、免疫组化、RT-PCR等,但是这些方法操作费时且特异性、灵敏度不高,而且不能对疾病作出早期诊断,而荧光定量PCR则能够弥补这些缺陷,且可进行高通量检测。PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒,其基因组中的M基因特别保守,通常被用来作为检测方法的靶基因。我们参考GenBank中已经公布的PEDV CV777株,设计出扩增M基因全长的特异性引物,另外设计一对特异性引物及TaqMan探针,扩增长度为196bp的片段。利用RT-PCR技术,从阳性病料中扩增出681bp的M基因,序列比对结果表明,M基因序列与CV777株相应M序列的同源性高达98%,并且与已经发布的其它PEDV毒株的M基因序列相比,同源性也均在97%以上。我们将M基因克隆进pMD18-T载体中,将鉴定正确的重组质粒进行10倍梯度系列稀释以作为阳性标准品,从而建立了一种快速检测PEDV含量的Taq...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 前言
1.1 PEDV病原结构
1.2 PEDV基因组结构
1.3 PED流行病学
1.4 PED临床症状
1.5 PED病理变化
1.6 PED致病机理
1.7 PED诊断方法
1.8 研究目的与意义
第二章 猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、质粒与菌株
2.1.2 主要实验器材
2.1.3 主要试剂和药品
2.1.4 主要培养基和缓冲液的配制
2.2 实验方法
2.2.1 荧光定量引物与探针的设计
2.2.2 核酸的提取
2.2.3 标准质粒的制备
2.2.4 荧光定量RT-PCR反应体系及标准曲线的建立
2.2.5 特异性实验
2.2.6 敏感性实验
2.2.7 重复性实验
2.2.8 临床样本的检测
2.3 结果与分析
2.3.1 PEDV M片段的扩增及重组质粒的鉴定
2.3.2 荧光定量RT-PCR反应体系及标准曲线的建立
2.3.3 特异性实验
2.3.4 敏感性实验
2.3.5 重复性实验
2.3.6 临床样本的检测
2.4 讨论
第三章 PEDV变异株致病性的初步研究
3.1 实验材料
3.1.1 病毒、抗体与实验动物
3.1.2 主要实验器材
3.1.3 主要试剂和药品
3.2 实验方法
3.2.1 攻毒病料的处理及荧光定量RT-PCR检测
3.2.2 攻毒实验
3.2.3 荧光定量RT-PCR检测粪便及组织
3.2.4 组织切片的制作
3.2.5 HE染色
3.2.6 免疫组化
3.3 结果及分析
3.3.1 攻毒病料的荧光定量RT-PCR检测结果
3.3.2 临床症状及病理变化
3.3.3 粪便的排毒规律
3.3.4 病理组织学检测结果
3.3.5 免疫组化检测结果
3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪病毒性腹泻的流行病学调查及分析[J]. 库旭钢,刘云波,凌泽熹,赵洪翠,廖荣斌,张坤,肖文,何启盖. 养猪. 2012(05)
[2]猪流行性腹泻病毒（PEDV）与抗病毒天然免疫[J]. 张百灵,陈建飞,邢雅玲,冯力,陈忠斌. 中国生物化学与分子生物学报. 2011(06)
[3]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[4]SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用[J]. 王金良,郭显坡,魏凤,沈志强. 中国兽医学报. 2010(10)
[5]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 张坤,何启盖. 畜牧兽医学报. 2010(08)
[6]TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用[J]. 刘邓,袁秀芳,冉多良,徐丽华,牛登元,王朝文,王一成. 中国动物传染病学报. 2010(01)
[7]猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析[J]. 吕茂杰,冯力,时洪艳,陈建飞,孙东波,申识川,崔小辰,王承宝,范秀萍. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[8]猪流行性腹泻研究概况[J]. 邬良贤,丘建华. 福建畜牧兽医. 2000(05)
[9]猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用[J]. 林志雄,季树根,李力复,陈茹,童昆周. 中国兽医科技. 1994(11)
[10]猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒的免疫电镜诊断的研究[J]. 王继科,刘长明,马思奇,王明,魏凤祥,于文涛,周金法. 中国畜禽传染病. 1991(02)
本文编号：3383030
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 前言
1.1 PEDV病原结构
1.2 PEDV基因组结构
1.3 PED流行病学
1.4 PED临床症状
1.5 PED病理变化
1.6 PED致病机理
1.7 PED诊断方法
1.8 研究目的与意义
第二章 猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、质粒与菌株
2.1.2 主要实验器材
2.1.3 主要试剂和药品
2.1.4 主要培养基和缓冲液的配制
2.2 实验方法
2.2.1 荧光定量引物与探针的设计
2.2.2 核酸的提取
2.2.3 标准质粒的制备
2.2.4 荧光定量RT-PCR反应体系及标准曲线的建立
2.2.5 特异性实验
2.2.6 敏感性实验
2.2.7 重复性实验
2.2.8 临床样本的检测
2.3 结果与分析
2.3.1 PEDV M片段的扩增及重组质粒的鉴定
2.3.2 荧光定量RT-PCR反应体系及标准曲线的建立
2.3.3 特异性实验
2.3.4 敏感性实验
2.3.5 重复性实验
2.3.6 临床样本的检测
2.4 讨论
第三章 PEDV变异株致病性的初步研究
3.1 实验材料
3.1.1 病毒、抗体与实验动物
3.1.2 主要实验器材
3.1.3 主要试剂和药品
3.2 实验方法
3.2.1 攻毒病料的处理及荧光定量RT-PCR检测
3.2.2 攻毒实验
3.2.3 荧光定量RT-PCR检测粪便及组织
3.2.4 组织切片的制作
3.2.5 HE染色
3.2.6 免疫组化
3.3 结果及分析
3.3.1 攻毒病料的荧光定量RT-PCR检测结果
3.3.2 临床症状及病理变化
3.3.3 粪便的排毒规律
3.3.4 病理组织学检测结果
3.3.5 免疫组化检测结果
3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]猪病毒性腹泻的流行病学调查及分析[J]. 库旭钢,刘云波,凌泽熹,赵洪翠,廖荣斌,张坤,肖文,何启盖. 养猪. 2012(05)
[2]猪流行性腹泻病毒（PEDV）与抗病毒天然免疫[J]. 张百灵,陈建飞,邢雅玲,冯力,陈忠斌. 中国生物化学与分子生物学报. 2011(06)
[3]猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白与感染细胞核磷蛋白的共定位分析[J]. 吕茂杰,陈建飞,时洪艳,陈小金,范秀萍,申识川,冯力. 微生物学报. 2011(05)
[4]SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用[J]. 王金良,郭显坡,魏凤,沈志强. 中国兽医学报. 2010(10)
[5]猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J]. 张坤,何启盖. 畜牧兽医学报. 2010(08)
[6]TaqMan荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立与初步应用[J]. 刘邓,袁秀芳,冉多良,徐丽华,牛登元,王朝文,王一成. 中国动物传染病学报. 2010(01)
[7]猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达及其亚细胞定位的初步分析[J]. 吕茂杰,冯力,时洪艳,陈建飞,孙东波,申识川,崔小辰,王承宝,范秀萍. 畜牧兽医学报. 2009(05)
[8]猪流行性腹泻研究概况[J]. 邬良贤,丘建华. 福建畜牧兽医. 2000(05)
[9]猪流行性腹泻微量血清中和试验的建立和应用[J]. 林志雄,季树根,李力复,陈茹,童昆周. 中国兽医科技. 1994(11)
[10]猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒的免疫电镜诊断的研究[J]. 王继科,刘长明,马思奇,王明,魏凤祥,于文涛,周金法. 中国畜禽传染病. 1991(02)
本文编号：3383030
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