利用CRISPR/Cas9技术对鸡AMHR2基因进行精确编辑

发布时间：2021-09-04 14:00

　　为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0... 

【文章来源】：家畜生态学报. 2020,41(06)北大核心

【文章页数】：7 页

【部分图文】：

报告载体水平的HEK293T细胞AMHR2基因敲除效率

试验组DF-1细胞在Puromycin药物筛选140 h后被收集提取细胞基因组DNA。为了进一步检测敲除载体的工作效率,对细胞基因组进行TA克隆检测。菌落成型后随机选取20个菌落挑单克隆进行菌落PCR初步鉴定,图7中有约500 bp的条带则为阳性TA克隆。随机选择10个阳性克隆(图7中)进行测序,结果如图8所示,DF-1细胞基因组中AMHR2基因的突变率约为60.0%(6/10),所有检测到的基因突变类型均为碱基缺失。3 讨 论

基因编辑是研究基因功能的重要方法之一,CRISPR/Cas9技术相较于ZFN和TALEN技术具有简单高效的特点,自发现以来在哺乳动物上有广泛应用[15-17]。CRISPR/Cas9技术在鸡中也有成功应用但仍处于初步阶段。2015年,Véron[12]对鸡胚的PAX7基因进行了敲除,首次实现了在鸡基因组上的编辑应用。然而,CRISPR/Cas9在鸡细胞中的应用存在着靶位点突变效率低的问题[18]。Cas9核酸酶对靶位点的特异切割是基于sgRNA能够准确识别目的基因的靶位点,但由于生物体的基因组极为复杂,sgRNA可能会与非靶位点进行错配,导致脱靶效应[19]。因此CRISPR/Cas9系统的靶位点的设计非常重要,有研究表明sgRNA的GC含量越高,对靶位点的切割效率越高[20]。为了利用CRISPR/Cas9技术对鸡的AMHR2基因进行特异敲除,首先应构建高效特异的Cas9敲除表达载体。不同于之前研究中对单一靶位点进行打靶的敲除系统,本研究通过crispr.mit.edu:807网站设计了位于鸡AMHR2基因第二外显子上的成对sgRNA靶位点,以期提高对AMHR2基因的打靶效率。图8 阳性DF-1细胞基因组的测序分析


本文编号：3383396