环介导等温扩增技术快速检测牛乳腺炎病原菌方法的建立
发布时间：2021-09-05 13:47
乳腺炎是影响奶牛生产的主要疾病之一。快速准确鉴定出引起奶牛乳腺炎发病的主要病原体,对奶牛乳腺炎的防治、患病牛只的隔离治疗、净化牛群以及保证牛群健康生产具有十分重要的意义。但在生产实践中,受到仪器设备、人员水平和养殖区域等现实条件制约,现有奶牛乳腺炎检测技术显的相对滞后。常规培养基检测病原的方法繁琐费时,而且经常出现假阳性结果。而利用PCR方法检测某一病原体的方法对操作人员水平和设备要求较高、不便在一线养殖中全面推广。因此,开发快速、特异、灵敏、便捷、经济适用的奶牛乳腺炎病原菌检测方法具有重要的应用推广价值和市场需求。环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型等温核酸扩增技术,因其检测的特异性好、灵敏度高、耗时短、可操作性强等多种优点,近些年该技术已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等多种病原生物的检测中,在人、畜等的病原物检测及疾病的早期诊断等领域有着十分广阔的应用前景。本研究通过技术优化和方案改进,建立了基于LAMP检测奶牛乳腺炎主要致病菌的方法。主要内容包括:（1）结合盐酸胍裂解液和核酸提取柱,建立了从牛奶中快速...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
奶牛乳腺炎发展示意图
进行链置换反应，实现恒定温度条件下对目的 DNA 片段进行体外快速扩增。该技术关键点是引物设计，引物设计主要包括两点：促使反应起始物的形成；扩增末端能够形成独特茎环结构以使反应能够循环。LAMP 扩增反应包括三个过程:引物设计、反应起始物形成以及扩增的往复循环。LAMP 反应检测的优点有：（1）特异性强、灵敏度高。比PCR 扩增的灵敏度高出1~2 个数量级；（2）反应快速高效、反应条件简单。不需要 PCR 的预变性步骤，核酸的扩增在水浴锅中或恒温箱恒温条件下反应1h 左右就可以完成；（3）结果易于观察。通过自然光下看浑浊度，直接观察或高速离心后观察是否有沉淀，也可加入不同的显色剂来观察颜色变化。3.2 LAMP 反应原理链置换型 DNA 聚合酶（如图 2）：这种聚合酶（Bst DNAPolymerase）最适温度是 65℃，在扩增双链 DNA 时能对其中一条链边解离边伸长。
LAMP 的扩增分大致分为三个阶段：1）循环模板合成阶段由于双链 DNA 模板在 60 ℃ ~65℃环境下处于不稳定、动态的平衡状态，此时在大片段链置换型 DNA 聚合酶( Bst DNApolymerase)的催化作用下，该反应体系的正向内引物 FIP 外引物 F3 依次与各自位点特异性结合（如图 3），形成两条各自互补的 DNA 单链，新合成的 DNA 单链其中一端存在能与自身互补配对的碱基片段，这部分自配对生成带有环状结构的 DNA 单链。随后反向内引物 BIP 和外引物 B3 依次结合到各自匹配的特异性结合位点，并打开DNA 单链在上一步形成的环状结构合成了两端反向的环状结构链。因此，当整条链呈现出哑铃状结构时，LAMP 扩增的起始阶段完成了。
【参考文献】：
期刊论文
[1]奶牛体细胞裂解方法的研究进展[J]. 冯万宇,周庆民,徐馨,张艳. 养殖与饲料. 2016(10)
[2]乳品中3种常见细菌多重PCR检测方法的建立[J]. 闫晗,吕国钦,张洋,张笑嫣,冯旭,王丽威. 食品与发酵工业. 2015(07)
[3]LAMP实时浊度法快速检测肠出血性大肠杆菌O157的研究[J]. 李碧霞,游淑珠,邝筱珊,冯家望,王小玉,唐食明,成晓维,许喜林. 现代食品科技. 2014(07)
[4]LAMP结合示差脉冲伏安法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立及临床应用[J]. 刘孝波,蒋栋能,项贵明,蒲晓允. 国际检验医学杂志. 2014(12)
[5]奶牛隐性乳房炎的检测[J]. 杨柏龄. 畜牧兽医科技信息. 2013(02)
[6]LAMP技术在动物病毒病原检测中的应用进展[J]. 周广舟,徐苏丽,谭晓荣,陈小兵. 中国人兽共患病学报. 2013(02)
[7]保健食品中沙门菌的快速检测方法[J]. 牛振东,孙伟,高春. 中国卫生检验杂志. 2013(01)
[8]应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J]. 唐梦君,周生,葛庆联,张小燕,蒲俊华,高玉时. 现代食品科技. 2011(06)
[9]乳品中肠球菌LAMP快速检测方法的建立及应用[J]. 姜侃,张东雷,金燕飞,陈小珍. 中国乳品工业. 2011(05)
[10]奶牛乳房炎主要病原菌及其分离鉴定方法研究进展[J]. 邓海平,蒲万霞,俞诗源,王玲,孟小琴. 中国草食动物. 2009(02)
博士论文
[1]奶牛肝功能酶检测与乳房炎白色念珠菌快速诊断试纸条研究[D]. 刘平.广西大学 2013
硕士论文
[1]南宁某牛场奶牛乳房炎调查及其快速检测方法的建立与应用[D]. 邹佳琪.广西大学 2016
[2]奶牛链球菌性乳房炎可视化LAMP检测方法的建立及应用[D]. 贺婷.广西大学 2014
本文编号：3385461
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：76 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
奶牛乳腺炎发展示意图
进行链置换反应，实现恒定温度条件下对目的 DNA 片段进行体外快速扩增。该技术关键点是引物设计，引物设计主要包括两点：促使反应起始物的形成；扩增末端能够形成独特茎环结构以使反应能够循环。LAMP 扩增反应包括三个过程:引物设计、反应起始物形成以及扩增的往复循环。LAMP 反应检测的优点有：（1）特异性强、灵敏度高。比PCR 扩增的灵敏度高出1~2 个数量级；（2）反应快速高效、反应条件简单。不需要 PCR 的预变性步骤，核酸的扩增在水浴锅中或恒温箱恒温条件下反应1h 左右就可以完成；（3）结果易于观察。通过自然光下看浑浊度，直接观察或高速离心后观察是否有沉淀，也可加入不同的显色剂来观察颜色变化。3.2 LAMP 反应原理链置换型 DNA 聚合酶（如图 2）：这种聚合酶（Bst DNAPolymerase）最适温度是 65℃，在扩增双链 DNA 时能对其中一条链边解离边伸长。
LAMP 的扩增分大致分为三个阶段：1）循环模板合成阶段由于双链 DNA 模板在 60 ℃ ~65℃环境下处于不稳定、动态的平衡状态，此时在大片段链置换型 DNA 聚合酶( Bst DNApolymerase)的催化作用下，该反应体系的正向内引物 FIP 外引物 F3 依次与各自位点特异性结合（如图 3），形成两条各自互补的 DNA 单链，新合成的 DNA 单链其中一端存在能与自身互补配对的碱基片段，这部分自配对生成带有环状结构的 DNA 单链。随后反向内引物 BIP 和外引物 B3 依次结合到各自匹配的特异性结合位点，并打开DNA 单链在上一步形成的环状结构合成了两端反向的环状结构链。因此，当整条链呈现出哑铃状结构时，LAMP 扩增的起始阶段完成了。
【参考文献】：
期刊论文
[1]奶牛体细胞裂解方法的研究进展[J]. 冯万宇,周庆民,徐馨,张艳. 养殖与饲料. 2016(10)
[2]乳品中3种常见细菌多重PCR检测方法的建立[J]. 闫晗,吕国钦,张洋,张笑嫣,冯旭,王丽威. 食品与发酵工业. 2015(07)
[3]LAMP实时浊度法快速检测肠出血性大肠杆菌O157的研究[J]. 李碧霞,游淑珠,邝筱珊,冯家望,王小玉,唐食明,成晓维,许喜林. 现代食品科技. 2014(07)
[4]LAMP结合示差脉冲伏安法快速检测肺炎克雷伯菌的方法建立及临床应用[J]. 刘孝波,蒋栋能,项贵明,蒲晓允. 国际检验医学杂志. 2014(12)
[5]奶牛隐性乳房炎的检测[J]. 杨柏龄. 畜牧兽医科技信息. 2013(02)
[6]LAMP技术在动物病毒病原检测中的应用进展[J]. 周广舟,徐苏丽,谭晓荣,陈小兵. 中国人兽共患病学报. 2013(02)
[7]保健食品中沙门菌的快速检测方法[J]. 牛振东,孙伟,高春. 中国卫生检验杂志. 2013(01)
[8]应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究[J]. 唐梦君,周生,葛庆联,张小燕,蒲俊华,高玉时. 现代食品科技. 2011(06)
[9]乳品中肠球菌LAMP快速检测方法的建立及应用[J]. 姜侃,张东雷,金燕飞,陈小珍. 中国乳品工业. 2011(05)
[10]奶牛乳房炎主要病原菌及其分离鉴定方法研究进展[J]. 邓海平,蒲万霞,俞诗源,王玲,孟小琴. 中国草食动物. 2009(02)
博士论文
[1]奶牛肝功能酶检测与乳房炎白色念珠菌快速诊断试纸条研究[D]. 刘平.广西大学 2013
硕士论文
[1]南宁某牛场奶牛乳房炎调查及其快速检测方法的建立与应用[D]. 邹佳琪.广西大学 2016
[2]奶牛链球菌性乳房炎可视化LAMP检测方法的建立及应用[D]. 贺婷.广西大学 2014
本文编号：3385461
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