干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白及其免疫效力的研究

发布时间：2021-09-06 03:59

　　本研究利用干酪乳杆菌表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白，通过口服方式免疫鸡，诱导机体局部黏膜免疫和全身系统免疫应答。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段，将目的片段构建在pLA穿梭质粒上，经过PCR验证，正确的命名为pLA-VP2。pLA-VP2重组质粒在大肠杆菌中经克隆增殖后，提取质粒，然后电转化到干酪乳杆菌中，再经过提取质粒，PCR验证，正确的命名为pLA-VP2/L. casei。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2，得到约90KDa的融合蛋白，与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应，具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光，且pLA-VP2/L. casei荧光强度强于pLA/L. casei对照组，应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率，约为80%。结果表明，IBDV VP2蛋白已成功展示在干酪乳杆菌表面。以构建的pLA-VP2/L. casei免疫雏鸡，诱导机体局部黏膜免疫和全身系统免疫应答，并通过攻毒检测重组干酪乳杆菌免疫保护效力。为了确定免疫... 

【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
符号说明
第一章 文献综述
    1.1 鸡传染性法氏囊病概述
        1.1.1 病原学特征
        1.1.2 分子生物学特征
    1.2 鸡传染性法氏囊病毒基因组结构
        1.2.1 VP1 蛋白
        1.2.2 VP2 蛋白
        1.2.3 VP3 蛋白
        1.2.4 VP4 蛋白
        1.2.5 VP5 蛋白
    1.3 传染性法氏囊病毒疫苗研究进展
    1.4 乳酸菌作为外源基因表达载体的研究进展
        1.4.1 益生菌
        1.4.2 乳酸菌作为外源基因表达载体的可行性
        1.4.3 乳酸菌作为口服疫苗载体对机体免疫系统的影响
        1.4.4 乳酸菌作为外源基因递送载体的研究
    1.5 本研究的目的和意义
第二章 重组干酪乳杆菌表达 IBDV B87 株 VP2 蛋白系统的构建
    2.1 材料
        2.1.1 质粒、菌株
        2.1.2 酶及试剂
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 引物的设计与合成
        2.2.2 目的基因片段的获取
        2.2.3 目的片段测序鉴定
        2.2.4 pLA-VP2 重组表达载体的构建
        2.2.5 重组干酪乳杆菌的构建
        2.2.6 重组干酪乳杆菌的鉴定
    2.3 结果
        2.3.1 IBDV B87 株 VP2 基因扩增结果
        2.3.2 重组质粒 pMD-VP2 的酶切鉴定结果
        2.3.3 重组质粒 pMD-VP2 的 PCR 鉴定结果
        2.3.4 重组质粒 pMD-VP2 的测序鉴定结果
        2.3.5 pLA-VP2 重组质粒 PCR 鉴定结果
        2.3.6 重组蛋白的 Western blot 检测结果
        2.3.7 重组干酪乳杆菌流式细胞检测结果
    2.4 讨论
第三章 pLA-VP2 重组干酪乳杆菌本体动物免疫原性的研究
    3.1 材料
        3.1.1 试验动物
        3.1.2 菌株
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 主要仪器
    3.2 方法
        3.2.1 IBDV 超强毒半数感染量（ID50)测定
        3.2.2 免疫剂量及免疫次数的探究
        3.2.3 免疫途径的探究
        3.2.4 免疫用重组干酪乳杆菌菌悬液的制备
        3.2.5 样本采集
        3.2.6 间接 ELISA
        3.2.7 脾脏 T 淋巴细胞的增殖试验
        3.2.8 病理切片的制作
    3.3 结果
        3.3.1 半数感染量(ID50)的测定
        3.3.2 pLA-VP2 重组干酪乳杆菌免疫方法的探究
    3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
致谢
附录
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]表达传染性腔上囊病病毒VP2蛋白重组乳酸菌的构建及其免疫保护效果[J]. 齐炳理,葛俊伟,乔薪瑗,姜艳萍,李一经.  中国兽医科学. 2009(11)
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[3]Vaccination against Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus Using Recombinant T4 Bacteriophage Displaying Viral Protein VP2[J]. Yong-Chang CAO Quan-Cheng SHI Jing-Yun MA Qing-Mei XIE Ying-Zuo BI Genetic Engineering Laboratory,Animal Science College,South China Agricultural University,Guangzou 510642,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(10)
[4]乳酸菌降胆固醇作用研究现状[J]. 韩俊华,盛晓甘,董彩凤,葛春美,张柏林.  中国乳品工业. 2002(03)
[5]传染性法氏囊病病毒的生态学与流行病学研究[J]. 周宗安,王永山,邓小昭,刁振宇,高建,施正良,罗函禄,方元.  中国兽医学报. 1998(05)
[6]鸡传染性法氏囊病病毒血清亚型的研究[J]. 朱爱国,李劲松,陈溥言,蔡宝祥.  中国畜禽传染病. 1992(04)
[7]鸡传染性法氏囊病血清Ⅰ型病毒亚型毒株的分离[J]. 李树根,黄生,林志雄,林英华,毕英佐,黄均尧,关世荣,戴彩润,黄碧珠,曾家喜.  中国畜禽传染病. 1991(05)



本文编号：3386702